Trizol法大鼠心肌总RNA提取方法探讨

trizol法提取rna的原理
Trizol法是一种常用的RNA提取方法，它是一种单步法，可以同时提取RNA、DNA和蛋白质。

该方法基于酚和胍的化学性质，通过酚的溶解性和胍的离子性来分离RNA、DNA和蛋白质。

Trizol法的原理是利用酚的溶解性质将细胞膜和细胞核膜破坏，使RNA、DNA和蛋白质释放出来。

然后，加入氯仿，使RNA、DNA和蛋白质分为两个相，RNA在上层，DNA和蛋白质在下层。

接着，加入异丙醇，使RNA从上层转移到异丙醇层中，形成RNA沉淀。

最后，将RNA沉淀用乙醇洗涤，去除杂质，得到纯净的RNA。

Trizol法的优点是简单、快速、高效，可以同时提取RNA、DNA 和蛋白质，适用于多种样品类型，如细胞、组织、血液、尿液等。

此外，该方法提取的RNA质量好，适用于后续的实验操作，如RT-PCR、Northern blot、RNA测序等。

但是，Trizol法也存在一些缺点。

首先，该方法对RNA的长度和结构有一定的限制，不适用于长链RNA和某些结构特殊的RNA。

其次，该方法对样品的处理和操作技巧要求较高，容易受到外界因素的影响，如温度、湿度、pH值等。

最后，该方法的成本较高，需要使用较多的试剂和设备。

Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用酚和胍的化学性质分离RNA、DNA和蛋白质。

该方法具有简单、快速、高效等
优点，但也存在一些缺点。

在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的RNA提取方法。

trizol提rna方法TRIzol提RNA方法简介TRIzol提RNA方法是一种常用的RNA提取方法，采用TRIzol试剂将RNA稳定在总RNA样品中提取出来，通过分离纯化使RNA的质量和完整性得到一定保证。

TRIzol提RNA方法具有以下特点：1. 适用范围广TRIzol提RNA方法不仅适用于多种类型的样品，如细胞、组织和微生物等，还可用于分离多种类型的RNA分子，如mRNA、rRNA和miRNA等。

2. 提高RNA的纯度和质量TRIzol试剂具有独特的成分，可以最大限度地去除DNA、蛋白质等干扰物质，提高RNA的纯度和质量。

同时，TRIzol提RNA方法还可以避免RNA的降解和失活，保证RNA完整性。

3. 操作简单、快速TRIzol提RNA方法操作简单，一般可以在1-2小时内完成RNA提取。

相对于其他RNA提取方法，TRIzol提RNA方法快速、高效。

TRIzol提RNA方法步骤TRIzol提RNA方法共分为以下步骤：1. 样品裂解将样品加入TRIzol试剂中，裂解细胞并溶解RNA。

2. 相分离将样品和TRIzol混合液沉淀，然后加入一个有机溶剂，使RNA与水相分离。

3. 提取RNA将RNA上清液收集起来，加入氯仿，进一步去除有机溶剂和DNA。

4. 沉淀RNA将RNA上清液沉淀，将RNA稳定在沉淀中，去除残留的有机溶剂和盐分。

5. 溶解RNA将RNA沉淀中的RNase-free水添加至RNA沉淀中，彻底溶解RNA。

如何提高TRIzol提RNA质量和完整性1. 样品处理不同类型的样品有不同的处理方式。

对于细胞和组织等样品，应尽量在收集后尽快进行TRIzol提RNA操作，避免RNA在细胞或组织中降解和失活。

2. TRIzol试剂的使用使用新鲜的TRIzol试剂，并根据使用说明操作。

避免直接接触试剂和皮肤等。

3. RNA逆转录和扩增在进行RNA逆转录和扩增前，应对RNA质量和完整性进行检测，以确保数据准确性。

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。

若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。

PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。

TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。

TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。

Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。

Trizol提取组织总RNA的方法实验原理：Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA 分离开。

水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

液氮研磨组织：实验准备：研钵、研棒、药匙清洗后高压消毒；线手套、烧杯高压消毒。

材料：1.5mlEP管，200μL EP管（RNA-Free）试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；75％乙醇（DEPC处理水：无水乙醇=1:3）；桌面清理干净，酒精擦拭消毒。

1.取出冻存于-80℃的组织，放于液氮中。

2.在研钵中导入部分液氮，对研钵、研锤进行预冷。

取出组织，放入含有液氮的研钵中，左手戴上线手套，外面套两层PE手套，扶住研钵，右手持研锤压碎组织。

Tip：为了防止组织研碎过程中蹦出，左手在刚开始研磨过程中可以护住研钵口；可以用研棒将组织聚集到一起进行研磨，这样更容易捣碎；研磨期间不断加入液氮，防止组织中RNA因温度升高降解；3.研磨完成后，将研磨好的组织粉末收集到已经编号的含有Trizol的EP管中。

如果组织较少，可以将Trizol 的量减半（500μL）。

4.接下来进行Trizol提取RNA操作Trizol 提取RNA实验准备：离心机预冷；70％乙醇预冷值-20℃。

1.将EP管上下颠倒，充分混匀，室温放置5分钟。

2.在通风橱中操作。

加入200ul（0.2倍体积）的氯仿，盖紧盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置5 min。

12000g，4℃离心15min。

Tip：使用1mL的枪吸取。

3.离心后溶液分为三层，RNA存在于上清中，离心管从离心机上拿下来时要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。

吸取上清的时候一定要轻，切忌吸取太多，少量即可（400-500ul），避免碰到下层沉淀。

Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。

然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。

最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。

所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。

2.氯仿：用于抽提RNA。

3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。

4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。

5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。

6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。

实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。

2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。

3.移液器：用于吸取试剂和样品。

4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。

5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。

准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。

2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。

3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。

实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。

2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。

3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。

4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。

5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。

注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

Trizol法大鼠心肌总RNA提取方法探讨戴先成;柴智锋;徐永城;王山青【摘要】目的探讨大鼠心肌总RNA的提取方法,为今后法医学研究和实践工作提供参考.方法用Trizol法,严格注意无RNA酶操作,通过裂解组织,分离、沉淀RNA 而提取大鼠心肌总RNA,并用分光光度计、凝胶电泳及RT-PCR检测结果.结果Trizol法能获得较高纯度和产量的完整总RNA.结论 Trizol法是提取总RNA可靠有效的方法,可望在法医学领域有较广的应用.【期刊名称】《刑事技术》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】2页(P15-16)【关键词】法医病理学;总RNA提取;Trizol法【作者】戴先成;柴智锋;徐永城;王山青【作者单位】浙江省诸暨市公安局,311800;浙江省诸暨市公安局,311800;浙江省宁波市公安局鄞州分局,315100;北京市公安局法医中心二部,102488【正文语种】中文【中图分类】DF795.1分子生物学技术已经在各个领域广泛运用，其中在RNA 方面的研究也正在被各领域研究人员所青睐，法医工作者也不例外。

但是由于RNA 降解快而使其应用大受限制，本文介绍以Trizol为主要试剂的总RNA 提取方法，并就其提取过程中的注意事项进行讨论，以期在法医学领域能有较好的应用。

1 材料与方法1.1 材料健康雌性Sprague－Dawley大鼠3只（8周龄，200±20g）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、Trizol（美国）、氯仿、异丙醇等试剂；ND－100分光光度计（美国）、Microfuge 22R4℃离心机（美国）、9700PCR 仪（美国）等设备。

1.2 方法实验准备：200℃干烤金属器械及玻璃器材4h、1／1000DEPC液浸泡塑料器材过夜后烘干待用；实验员戴无RNA 酶手套、医用口罩及手术帽，用3%H2O2 擦洗操作台及设备。

实验操作：（1）断颈处死大鼠，立即剪取新鲜心肌组织50mg～100mg，液氮浸泡数分钟（直至组织块不冒气泡、完全沉到液氮底部为止），再放入已加1mL预冷Trizol的玻璃匀浆器，冰上碾磨15min，转移混合液至2mL EP管并室温裂解5min；（2）4℃、12000r／min离心10min，后转移上清至新管，向新管加氯仿200μL，盖紧并振荡混匀，手动剧烈摇晃15sec，室温放置3min；（3）4℃、12000r／min离心15min，再用200μL 小枪头分多次转移上清至新管，向新管加异丙醇500μL，盖紧混匀，手动摇晃15sec，室温放置10min；（4）4℃、12000r／min离心10min，弃上清并加入75%乙醇1mL，温和震荡、悬浮沉淀；（5）4℃、7500r／min离心5min，弃上清并在超净工作台风干；（6）用20μL 无RNA 酶水溶解沉淀，ND－100 分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测；（7）将RNA 逆转录成cDNA，并对管家基因GAPDH 进行PCR 扩增及电泳检测。

心肌细胞总RNA 的提取1. 匀浆化作用：50mg 心肌（置于1ml 玻璃匀浆器内）加1mlTrizol 溶液①进行研磨匀浆液（倒入1.5mlEP 管中）颠倒混匀10下，室温静置5分钟，12，000rmp4℃离心5分钟。

下层液（弃去） 上清液（置新的EP 管中）2.分离阶段上清液加入氯仿（0.2ml ）,剧烈震荡15秒，乳化后，室温静置5分钟，12，000rmp4℃离心15分钟。

分为三层的匀浆液3.RNA 的沉淀 三层匀浆液白色中间层 无色的上清液 下层有机相（取0.2ml 置新的EP 管中）加入0.2ml 异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10分钟，12，000rmp4℃离心10分钟。

具沉淀上清液4.RNA的洗脱具沉淀上清液上清液（弃去）沉淀缓慢沿EP管壁加入75%乙醇1ml(DEPC水配制并预冷)②，轻轻振摇，12，000rmp4℃离心5分钟。

乙醇（弃去）沉淀（新）5.RNA的再溶解沉淀（新）室温干燥3-5分钟，加入适当的Rnase-free水（20ul）③溶解。

溶液（于-80℃保存）①Trizol溶液：在2000ml的烧杯中加入以下物质，混合均匀：500ml重蒸苯酚；250g异硫氢酸胍；293mL蒸馏水；17.6mL 0.75M 柠檬酸钠溶液（pH≥7）26.4mL 10％sarcosy（十二烷基肌氨酸钠）溶液50mL 2M NaAc溶液(pH≥4)TRIzol需4℃低温保存，保质期约一年。

100mL TRIzol试剂市场售价约478元人民币。

注释：（1）水和苯酚部分互溶，Trizol中苯酚被水饱和，形成均匀溶液；（2）NaAc等盐类的作用是提供缓冲环境。

②75%乙醇（DEPC水配制）：先配置DEPC水，1000 ml双蒸水加1 ml DEPC，不用灭菌。

100%的乙醇与DEPC水按3：1的体积比配置；一段时间（一般12小时左右）后再高压灭菌。

③Rnase-free水：1000 ml双蒸水加1 ml DEPC，不用灭菌。

Trizol总RNA抽提步骤1样品的处理1.1样品的匀浆A.贴壁细胞尽量弃去培养液，直接往直径3.5cm的培养板中加入1ml Total RNA Extraction Reagent 覆盖并反复吹打裂解细胞。

【注】：1）依据培养板的面积而不是细胞的数量来决定所需的Total RNA Extraction Reagent 量（每10cm2 加1ml）。

2）当加入Total RNA Extraction Reagent量不足时可导致抽提的RNA有DNA污染。

3）贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全裂开，并已释放RNA，继续后续实验即可。

B. 悬浮细胞离心收集细胞，每5 ×106-107个细胞加入1 ml Total RNA Extraction Reagent，用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。

【注】：在加入Total RNA Extraction Reagent前避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。

裂解某些酵母和细菌可能需要使用匀浆器。

C. 动/植物组织取新鲜动植物组织或-70℃冻存动物组织在液氮中充分研磨，按照表1加入适当量Total RNA Extraction Reagent 混匀。

或取新鲜动植物组织尽量剪碎，加入适当Total RNA Extraction Reagent量，匀浆仪进行匀浆处理。

【注】：样品体积一般不要超过Total RNA Extraction Reagent体积的10%。

1.2 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。

1.3（可选）在4℃条件下，12000rpm 离心10min，取上清。

【注】：如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。

离心后的沉淀中包含有细胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂应尽量去除，取澄清的匀浆液进行后续实验。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理RNA（核糖核酸）在许多生物学过程中起着至关重要的作用，如基因表达调控、蛋白质合成等。

Trizol 法是一种广泛应用于提取细胞或组织中总 RNA 的方法。

下面将详细介绍 Trizol 法提取 RNA 的实验步骤及原理。

一、实验原理Trizol 试剂主要成分包括苯酚、异硫氰酸胍等。

异硫氰酸胍是一种强变性剂，能够迅速破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，并抑制RNA 酶的活性，从而保护RNA 不被降解。

苯酚则能够促使蛋白变性，并使核酸从蛋白核酸复合物中释放出来。

在 Trizol 处理样品后，RNA 会溶解在水相中。

通过加入氯仿，离心后可将溶液分为水相、有机相和中间层。

RNA 存在于水相中，而 DNA 和蛋白质分别存在于有机相和中间层。

收集水相，通过异丙醇沉淀可得到 RNA。

最后，用乙醇洗涤 RNA 沉淀以去除残留的盐和杂质，从而获得较为纯净的 RNA。

二、实验步骤1、材料准备细胞或组织样本Trizol 试剂氯仿异丙醇75%乙醇（用 DEPC 水配制）无 RNA 酶的离心管、移液器吸头离心机涡旋振荡器2、样本处理细胞样本：将培养的细胞收集到离心管中，离心弃去培养液。

加入适量的 Trizol 试剂，反复吹打使细胞充分裂解。

组织样本：将新鲜组织切成小块，放入液氮中速冻，然后研磨成粉末。

加入适量的 Trizol 试剂，充分匀浆。

3、室温静置裂解后的样本在室温下静置 5 分钟，使核蛋白体完全解离。

4、加入氯仿按每 1ml Trizol 试剂加入 02ml 氯仿的比例，剧烈振荡 15 秒，然后室温静置 2 3 分钟。

5、离心在 4℃下，以 12000g 离心 15 分钟。

离心后，溶液分为三层：上层为无色的水相，含有 RNA；中间层为白色；下层为红色的有机相，含有 DNA 和蛋白质。

6、转移水相用移液器小心地将上层水相转移到一个新的无RNA 酶的离心管中，避免吸取中间层和有机相。