《高效液相色谱法》PPT课件

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《高效液相》课件

蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用，如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异进行分离，通过检测器进行检测，收集各个组分，达到分析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的填料。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望

高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt

色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ，低压汞灯。
② 可调波长： 190 ～ 800mm ，钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱石英窗光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统

waters-e高效液相色谱ppt课件

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀泵
色谱柱
泵输液进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统柱温箱液晶显示器内置的柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕

仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件

填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和
不溶于水非极性
极性增加非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography

高效液相色谱法培训PPT课件

注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯度斜率，使各组分在合适的保留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分能够充分分离，同时避免过长的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度，确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测组分浓度在该范围内时，测定结果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性，确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控制图，包括平均值、标准差和控制限等指标。
VS
发展历程及应用领域

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优点：固定相不易流失适用于各种样品的分离分析
分类
正相键合相色谱法：极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物反相键合相色谱法：非极性键合相，如C18柱、C8柱适用：非极性至中等极性化合物
1、反相键合相色谱法（RP-HPLC）
1）分离原理
流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。
中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为氯低碳型： R1、R2都是氯
表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例。
作用：决定了键合相是分配还是吸附占主导
封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性 > 固定相极性
问：①哪个先出柱
②若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例?
2、正相键合相色谱法（NP-HPLC）
1）分离机制： 2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3）流动相：极性小
底剂 + 有机极性调节剂 ✓ 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇
正相键合相色谱法（NP-HPLC） 4）流动相极性与k的关系：
流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓
5）出柱顺序：极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱
6）适用：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等
3．离子对色谱法（IPC或PIC）
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离
Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5m ）色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。流动相： (A)乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱： 0-30min：A 28%，B 72%； 30-53min： A 28％升至34％，B 72％降至66％； 53-70min： A 34％升至80％，B 66％降至20％。流速：1.0 ml·min-1；
第3节各类高效液相色谱法
吸附色谱法化学键合相离子对色谱法
一、吸附色谱法 1．分离原理 2．固定相：极性和非极性固定相 3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂
二、化学键合相色谱法
（bonded phase chromatography, BPC）
化学键合相：采用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上。
1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（
dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱
2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 1ml/min
3. 柱温的选择：选室温25-300C左右。太低，流动相黏度增加，
太高容易产生气泡
二、柱外展宽
从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。减免方法：应尽可能减少柱外死体积
第12章高效液相色谱法
high performance liquid chromatography HPLC
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
固定相颗粒较大，不均匀常压下输送流动相柱效低分析周期长
现代液相色谱
固定相颗粒小，均匀
高压下输送流动相柱效高分析周期短
第2节基本理论-速率理论
2. 纵向扩散项 B/u
样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽
B=2γDm Dm ∝T/η
液相色谱中Dm比GC中小105
u是最佳流速的3-5倍
B/u忽略
3.流动的流动相传质阻力项Cmu
流动相本身，处于不同层流的分子具有不同流速。
Cm

d
2 p
/
Dm
Dm ∝T/η
减免方法：1）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇）
1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸
2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱
3．洗脱方式
1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱
2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）
4. 静态流动相传质阻力项Csmu
原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相引起
影响Csmu的因素与Cm相同
5. 固定相的传质阻力项Csu
影响因素：固定相内部阻力影响
Cm

d
2 f
/
Ds
减免方法：减少固定相液膜厚度 ——化学键合相
6、HPLC法中分离条件的选择
H = A + （Cm+Csm）u
底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑
5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱
6）适用：非极性-中等极性组分
例：用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇水（95：5）
一、柱内展宽
H A B / u (Cm Csm Cs )u
Csm为静态流动相传质阻力系数
1. 涡流扩散项 A
组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽。
影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度
减少方法： a 降低dp：目前商品柱多采用3-5μm粒径 b 降低λ：采用球形、均匀分布固定相。
检测波长：230℃；
DAD1 E, Sig=275,16 Ref =of f (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG035.D) mAU
20
Luna
0
0
10
k↓，组分tR↓
反相键合相色谱法（RP-HPLC）
2）固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
十八烷基键合相：常用的非极性键合相
R1
Si
OH + Cl Si
C18H37
R2
R1
Si O Si
R2
C18H37 + HCl
键合相分类
高碳型：R1、R2是两个甲基特点：载样量大，保留能力强