大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

一、体外肝细胞损伤模型建立(CCｌ4与H2O2)ﻫ 1 大鼠肝细胞得分离与培养大鼠4％戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以3７℃通入Ｏ２得Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。

将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5％小牛血清得清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,２00目尼龙网过滤,低速离心(５0０r·miｎ-1,1 mｉｎ,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次、然后用完全1640培养液(内含10％小牛血清,10５U·L－1青霉素,1０0 mg·L—1链霉素与10 mg·L-1胰岛素)制成１×109个·L-１肝细胞悬液、分离得肝细胞经0、6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于９0％,高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定9９％为肝实质细胞。

将上述肝细胞悬液分别加入２４孔(每孔１mｌ)与96孔(每孔０。

１ml)培养板中,置３７℃,5%CO2培养箱中培养。

１2～１6 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长、ﻫ2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度得ＣＣl4〔(1～1６mｍｏｌ·Ｌ-1),以少量得二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0、1％(体积分数)〕,作用不同时间(1～12h)后,收集２4孔板中培养上清检测AST,以及肝细胞得MDA含量与ＧSHpｘ活性;同步测定96孔板中培养肝细胞得MTT反应。

根据检测结果制备CＣｌ4诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线、选择最造损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设３个复孔、３H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立同法更换培养液,加入不同浓度得H２O2(０.２～３。

2 ｍmol·Ｌ—１),作用不同时间(0、5～4 h)后,收集24孔板中培养上清检测AＬT,测定肝细胞得MDA含量;同步测定９６孔板中培养肝细胞得MTT反应。

大鼠急性酒精性肝脑损伤模型的建立刘青青;李永儒;李高婷;刘浪飘;杨一;彭云;杨艳【摘要】目的:探索建立简便有效的大鼠急性酒精性肝脑损伤动物模型.方法:将SD 大鼠随机分成对照组和模型组,模型组大鼠以52°白酒进行灌胃,第1天的灌胃剂量为7ml/kg,随后1周的灌胃剂量为10ml/kg,对照组灌胃等体积水.实验结束后,对大鼠进行体重增长幅度、肝指数计算,检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)含量及肝脑组织中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(SOD)活性,脑组织中钙离子(Ca2+)含量、ATP酶活性.结果:与对照组比较,模型组大鼠的体重增长幅度显著降低,血清中ALT、AST和TG显著升高,肝指数、肝脑组织MDA含量显著升高,而SOD活性显著降低,脑Ca2+含量显著升高、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低(P<0.001).结论:实验成功有效地在短时间内建立了大鼠急性酒精性肝脑损伤模型,可应用于护肝醒脑保健食品药品的评价研究.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)016【总页数】3页(P2373-2375)【关键词】急性酒精性肝脑损伤;大鼠;动物模型【作者】刘青青;李永儒;李高婷;刘浪飘;杨一;彭云;杨艳【作者单位】西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市646000;西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市646000;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市 646000【正文语种】中文【中图分类】R575酒精性肝损伤又称酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒所致的慢性肝病。

10种细胞损伤模型建立方法转载请注明来自丁香园发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：细胞细胞培养技术专题义翘神州丁香园丁香通点击次数：997现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。

一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。

将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。

然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。

分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。

将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx 活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。

原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。

本文将探讨原代肝细胞培养的方法。

原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。

它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。

原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。

首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。

一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。

然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。

常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。

这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。

接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。

一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。

在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。

此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。

然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。

首先，选择合适的培养基是非常重要的。

常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。

这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。

其次，细胞密度的控制也非常重要。

通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。

此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。

温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。

大鼠肝脏脱细胞实验报告大鼠肝脏脱细胞实验报告一、引言大鼠肝脏脱细胞实验是一种重要的实验技术，用于去除肝脏中的细胞，从而获取纯净的细胞外基质。

这种方法可以为肝脏再生、组织工程和移植等研究提供可行的基础。

本报告将详细介绍大鼠肝脏脱细胞实验的步骤、原理和结果。

二、材料与方法2.1 实验动物选取健康雌性大鼠作为实验对象，年龄在8-12周之间，体重在200-250g之间。

2.2 实验仪器与试剂- 离心机- 培养皿和离心管- 生理盐水- 胰酶溶液- DNase I溶液2.3 实验步骤1. 麻醉大鼠：使用适量的异氟烷或七氟烷对大鼠进行全身麻醉。

2. 切开腹部：用消毒剂清洁大鼠的腹部，并进行剪毛。

通过一个中线切口，将腹部完全切开。

3. 取出肝脏：小心地将肝脏取出，并放入含有生理盐水的培养皿中。

4. 清洗肝脏：用生理盐水轻轻冲洗肝脏，去除血液和其他污物。

5. 制备胰酶溶液：按照说明书的要求，制备适量的胰酶溶液。

6. 消化肝组织：将肝脏切成小块，并在胰酶溶液中消化1-2小时。

7. 离心分离细胞：将消化后的肝组织离心，去除上清液，留下沉淀。

8. 消化残渣：将沉淀加入含有DNase I溶液的培养皿中，进行进一步消化。

9. 离心分离细胞外基质：再次离心后，去除上清液，留下纯净的细胞外基质。

三、结果与讨论3.1 实验结果经过以上步骤，成功地从大鼠肝脏中提取了纯净的细胞外基质。

观察到细胞外基质呈现出透明、凝胶状的特点，没有明显的细胞残留。

3.2 实验讨论大鼠肝脏脱细胞实验是一种有效的方法，可以去除肝脏中的细胞，并获取纯净的细胞外基质。

这种方法对于肝脏再生和组织工程研究具有重要意义。

通过去除细胞，我们可以更好地研究肝脏基质成分及其对细胞行为和功能的影响。

四、结论本实验成功地展示了一种从大鼠肝脏中提取纯净细胞外基质的方法。

通过该方法，我们可以进一步研究肝脏再生和组织工程等领域，并为相关临床应用提供理论依据。

这项技术具有较高的可行性和应用潜力，值得进一步深入研究和探索。

肝损伤动物模型的造模方法
1. 化学物质诱导，这是最常用的方法之一，可以使用一些化学
物质如四氯化碳（CCl4）、醋酸乙酯（TAA）、二甲基硫醚（DME）
等来诱导肝损伤。

这些化学物质可以通过不同的途径进入动物体内，导致肝细胞损伤和肝功能异常。

2. 手术诱导，通过手术方法，可以直接对动物的肝脏进行切割、缺血再灌注等操作，从而引起肝损伤。

这种方法可以控制损伤的程
度和范围，适用于研究特定类型的肝损伤模型。

3. 遗传工程模型，利用转基因技术或基因编辑技术，可以构建
特定基因缺陷的动物模型，如肝细胞特异性基因敲除或过表达，从
而模拟特定的肝损伤情况。

4. 营养学诱导，通过控制动物的饮食，可以诱导脂肪肝、酒精
性肝病等肝损伤模型。

例如，高脂饮食可以导致脂肪肝，酒精饮食
可以导致酒精性肝病。

5. 辐射诱导，辐射也可以用来诱导肝损伤，如通过X射线或其
他辐射源对动物的肝脏进行照射，引起肝细胞的损伤和炎症反应。

总的来说，选择合适的肝损伤模型方法需要考虑研究的具体目的、动物种类、研究经费和实验条件等因素，并且在进行实验时需要严格控制实验条件，确保模型的可靠性和稳定性。

同时，也要遵守动物实验伦理规范，保障动物的福利和权益。

大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。

打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。

剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。

（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。

（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。

用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。

（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。

（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。

后续隔天换液培养。