脓毒血症动物模型具体步骤及说明

中重度脓毒症长期生存大鼠模型的建立焦裕霞;熊君宇【摘要】目的：建立中重度脓毒症长期生存大鼠模型，观察脓毒症自然转归的过程，为研究脓毒症提供新思路和方法。

方法将40只SD大鼠分为对照组（ sham 组，8只）与盲肠结扎穿孔术组（ cecal ligation and puncture， CLP组，32只），所有操作均在小动物麻醉机，七氟烷吸入麻醉下完成。

所有大鼠在其右颈部建立动静脉通路。

术后恢复24 h后，CLP组大鼠通过盲肠结扎穿孔术致脓毒症。

手术完毕后将大鼠转移到恢复室（室内温度22～25℃），单笼饲养。

术后静脉补液按1∶1比例分别给予6％HEAS和5％葡萄糖注射液，第1、2天补液量为20 mL／kg／12 h，之后液体减半直至大鼠开始饮食。

根据大鼠生存情况CLP组大鼠自然分为生存组（survival组）和死亡组（dead组）。

观察术后大鼠至30 d，记录大鼠的症状表现、体重变化、IL⁃10血浆浓度的变化，并解剖观察腹腔内脏器改变。

结果（1）CLP组术后24 h内生存率为75％，72 h内生存率为62�5％，7 d内生存率为50％。

（2）根据脓毒症严重程度评估系统，32只CLP组大鼠在术后24 h均达到中重度脓毒症程度。

（3）手术后，survival组与sham组体重均有下降。

survival组大鼠从第4天开始体重下降明显（P＝0�017）。

survival组大鼠在术后第6天体重下降至最低，较原体重下降（8�51±2�23）％；sham组则在术后第4天体重最低，较原体重下降（2�73±1�82）％，两组差异具有统计学意义（ P ＝0�026）。

两组大鼠在术后第30天时，体重的最大升高率（ sham 组（16�16±2�39）％与survival组（13�03±3�74）％比无明显差异（P＝0�29）。

（4）术后1 d与术前（0 d）相比，三组IL⁃10血浆浓度均有升高，survival组（P＝0�000）和dead组升高明显（P＝0�010）。

大鼠脓毒症模型建立方法
嘿，你知道咋给大鼠整出脓毒症模型不？先得选好健康的大鼠哇，这就跟挑运动员似的，得挑身强体壮的。

然后给大鼠来点细菌或者毒素啥的，让它感染上。

但这可得小心着点儿，别整太多把大鼠给搞死了。

就像做饭放盐似的，得恰到好处。

这过程安全不？那肯定得小心再小心哇！稍有不慎大鼠可能就一命呜呼了。

稳定性嘛，也得看操作手法。

要是技术不过关，那可就没准儿了。

那这脓毒症模型有啥用呢？哎呀，用处可大了去了。

可以研究脓毒症的发病机制呀，找到治疗的办法。

就好比侦探破案，得先有现场才能找出凶手嘛。

我听说有个实验室就用这方法做脓毒症模型，效果还不错呢。

通过观察大鼠的症状和生理指标，找到了一些治疗的新思路。

这不是超棒嘛！
大鼠脓毒症模型建立虽然有难度，但真的很有意义，值得一试。

浅谈建立脓毒症动物实验模型的新方法高宇;陈慧;刘艳苓;谢莹;张佳丽;栾泽柱;陈桂荣【期刊名称】《当代医药论丛》【年(卷),期】2018(016)008【摘要】目的:分析建立脓毒症动物实验模型的新方法.方法:将60只SD大鼠随机分为6组,分别为模型组1、模型组2、模型组3、模型组4、模型组5和空白组,每组各有10只大鼠.向1～5组模型组大鼠的腹腔内注射浓度为10％的大鼠粪便匀浆进行造模.在造模完成10 h后,分别采集这6组大鼠眼眶静脉丛的血液,检测、对比其血清中TNF-α 和IL-6的水平.在造模完成48 h后,用无热原的针筒心尖分别采集这6组大鼠200μl的血液,检测、对比其血清脂肪酶(LPS)的水平.对这6组大鼠进行解剖,取其心、肝、脾、肺、肾组织,对这些脏器组织进行病理检查和研究.结果:这1～5组模型组大鼠血清LPS、IL-6和TNF-α 的水平均高于空白组大鼠,P<0.01.与空白组大鼠相比,这1～5组模型组大鼠的心、肝、肺、肾中均存在大量的炎性浸润和明显的损伤.结论:本次研究中所使用的脓毒症大鼠的造模方法较为接近临床肠源性脓毒症的发病机制.【总页数】4页(P152-155)【作者】高宇;陈慧;刘艳苓;谢莹;张佳丽;栾泽柱;陈桂荣【作者单位】辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连 110033【正文语种】中文【中图分类】R563【相关文献】1.联合应激法建立单纯心理应激动物实验模型的研究 [J], 徐东宝;王杰;于燕妮;汪元河;黄江;戴佳琳;夏冰2.改良动静脉转流术动物实验模型的建立 [J], 李春江;郑秋涛;丁俊连;王海燕;张桂云;戚素银3.地雷爆炸伤动物实验模型的建立 [J], 张森;韩庚奋;叶广函;赖西南;王爱民;王丽丽4.上颌矢状扩弓的动物实验模型的建立 [J], 尉静;左艳萍;苑迎娇;刘亚非5.脓毒症动物实验模型研究进展 [J], 陈海鸣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

广西医科大学学报2020Aug ；37（8）JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY脓毒症动物模型的研究进展*彭凤辉，邓晓彬，吕立文△（广西壮族自治区人民医院急诊科，南宁530021）摘要脓毒症严重威胁人类生命健康，目前其发病机制仍不清楚，脓毒症模型的建立有助于人们更好的研究脓毒症。

本文就脓毒症动物模型的种类，建模方法，优、缺点，适用范围等进行综述，为日后脓毒症研究中动物模型的选择提供参考。

关键词脓毒症；动物模型；内毒素；盲肠结扎穿孔中图分类号：R459.7；R-332文献标志码：A文章编号：1005-930X （2020）08-1577-05DOI ：10.16190/ki.45-1211/r.2020.08.031Research progress in animal models of sepsisPeng Fenghui,Deng Xiaobin,LüLiwen .(Emergency Department,People ’s Hospital of Guangxi Zhuang Autono-mous Region,Nanning 530021,China)AbstractSepsis is a serious threat to human life and health,and its pathogenesis is still unclear.The establish-ment of sepsis models will help researchers study sepsis.This article reviews the types of sepsis animal models and their modeling methods,advantages,disadvantages,scope of application,etc.,so as to provide information for the selection of animal models in sepsis research in the future.Keywords sepsis;animal model;endotoxin;cecal ligation and perforation*基金项目：广西壮族自治区人民医院青年基金资助项目（No.QN2018-4）；2019年黎介寿肠道屏障研究基金资助项目（No.Z-2017-24-2009）；广西科技攻关计划资助项目（No.桂科攻15277007）△通信作者，E-mail ：******************收稿日期：2019-05-23尽管脓毒症的研究不断有新突破，其发病机制及病理生理学的研究也越来越深入，但临床上脓毒症的发病率和死亡率在全球范围内仍是呈递增的趋势，其发病机制仍不清楚，脓毒症是导致重症患者死亡的主要原因，国内一项多中心流行病学调查显示，严重脓毒症在ICU 的发病率为8.68％，死亡率高达44.7％，人均消耗医疗费用为11390美元/年（502美元/d ）[1]。

脓毒症动物模型制作及评价脓毒症动物模型是研究脓毒症发病机制和临床防治的基础。

建立标准的符合临床的脓毒症动物模型是脓毒症研究领域重点课题之一［1］。

本文就脓毒症动物模型制作中动物种类选择、制作方法等，予以综述并进行模型评价。

1 脓毒症动物模型动物以及制作方法的选择近交系小型动物如大鼠、小鼠或豚鼠，自身纯度较高、无特异性病原菌且价格较低。

大型哺乳动物，如猪、羊、狗等动物，可进行血流动力学监测和提供充足标本，便于进行较长试验观察。

灵长类动物免疫系统与人类高度相似，可用于评价炎性细胞因子以及免疫系统反应，但价格昂贵而且受到严格的伦理学制约。

另外，动物自身特点也可供实验利用：如羊对内毒素敏感，只需相当于狗的几十至几千分之一剂量（0.6μg/kg）即可出现肺血管损伤等脓毒症症状［2］。

猪肾脏、心血管和消化系统的生理特点和解剖结构与人类最相似，多用于严重脓毒症器官功能障碍的研究。

具有明确基因特征动物如内毒素耐受型敏感型小鼠，成为从分子水平揭示脓毒症发病机制的重要工具［3］。

脓毒症动物模型使用的制作方法也是需要考虑的重要问题。

不同种属宿主对内毒素或致病菌的敏感性、反应性各异：如啮齿类动物、猫和狗对内毒素具有一定的耐受性，而灵长类动物、兔和羊则对内毒素较敏感。

即使是相同动物对不同细菌侵袭反应也不同：如腹腔注射金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的小鼠，抗生素可诱发前者循环中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的早期释放，而后者TNF-α释放在时间和变化幅度上均无明显影响。

在应用抗TNF-α抗体分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对感染的大鼠进行治疗时，结果显示对后者的保护作用优于前者［4］。

即使是同一种动物同一种制模病原体，采取的攻击方式和剂量不同，所引起的动物体内细胞等炎性因子反应亦不同。

如给予亚致死量的LPS可诱导动物产生高动力循环特点，而致死量LPS则使动物呈现低动力循环特点。

所以脓毒症动物模型的选择，除了要考虑研究的目的以及路径之外，还要考虑制模所使用的方法以及在研究结果的解释方面考虑模型自身的特点以及局限，作出合理客观的解释。

大鼠盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症模型脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatoy response syndrome，SIRS)，临床上证实有致病菌侵袭存在或有高度可疑的感染性病灶，临床中多以常见并发症出现在重度感染、大面积烧伤、严重创伤或大手术术后的危重患者当中。

脓毒症一旦发生，进展迅速，短时间可由全身炎性反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症进展为重度脓毒症(severe sepsis)(合并器官功能不全)、脓毒症休克(septic shock)(并发充分液体复苏亦无法纠正的低血压)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，以上三者可贯序发生，亦可同时发生，严重危及患者生命，产生极高的致死风险。

虽然目前已经有许多动物模型用来复制脓毒症，但盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症的啮齿动物模型仍然是目前应用最广泛的脓毒症动物模型。

1.实验动物SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.实验周期2d4.建模方法1.称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。

2.沿腹白线切开腹腔约2cm，找出盲肠，用5-0缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。

轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用5-0缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。

3.待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。

4.2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后，于腹主动脉取血5ml，室温静止2h，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。

脓毒症相关性脑病大鼠动物模型的建立脓毒症相关性脑病在脓毒症患者是一种常见并发症，合并脓毒症相关性脑病者病死率明显增加。

目前临床对于脓毒症相关性脑病仍是排除性诊断，缺乏客观的诊断指标，如生化指标、影像学指标、电生理学指标等，导致流行病学及发生机制均不明确，因此确立相对客观统一的诊断标准势在必行。

动物模型的选择建立对其机制及治疗方法研究具有重要意义。

研究人员应用脑电图和诱发电位监测早期诊断脓毒症相关性脑病，取得一定效果，但尚未形成统一结论。

本研究根据已有脓毒症相关性脑病模型研究的进展，选用盲肠结扎法（CLP）建立脓毒症模型，通过监测大鼠神经行为学改变、脑电图信号及体感诱发电位改变来早期诊断脓毒症相关性脑病，并对所建立的大鼠脓毒症脑病模型进行分析，为以后的研究提供参考。

1 材料与方法1.1 实验动物清洁级成年雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由中南大学动物学部提供。

1.2 主要药品、试剂、仪器PBS购自鼎国生物工程公司，水合氯醛为中南大学湘雅医院药剂科化学分析室配制；多聚甲醛购置岳麓区鼎盛实验器材公司；戊二醛、无水乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、锇酸等由中南大学病理教研室提供。

套管针购置BD公司。

脑立体定位仪，RM6240生物信号记录器，Olympus BX41型光学显微镜（日本），LKB-Ⅲ型超薄切片机（瑞典），H-7500型透射电镜（日本），石腊切片机（美国），生化培养箱（广东），格兰士微波炉WP700，隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），荣事达家用冷藏冰箱BCD-202，MIAS医用图像分析管理系统电子摄像。

1.3 实验方法1.3.1 大鼠脑电及诱发电位监测电极放置30只大鼠称质量、编号分别在造模前10 d放置脑电监测电极。

水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠头部用立体定位仪固定，常规外科消毒，在头颅中间矢状位作3 cm的皮肤切口，将前囟点和其他颅骨缝暴露。

在颅骨面行局麻（10%利多卡因喷雾），移去骨膜。

CLP致脓毒血症大鼠模型建立一、实验目的利用CLP技术建立脓毒血症大鼠模型二、实验原理脓毒血症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔感染，所以腹腔感染模型是目前最常见的动物模型。

鼠类盲肠结扎穿刺（CLP）是临床研究脓毒血症常见模型，是模仿腹腔脓毒血症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致脓毒血症。

三、实验材料和设备成熟期雄性Sprague-Dawley大鼠，体重400-500g。

外科手术器械：手术台，手术刀，刀片，剪刀，刮毛器，镊子，止血钳，持针器，缝皮针，1号线，4号肠线，18g针头，血管夹，医用胶布，PE50导管（厂家），探针，硬膜外穿刺针，肝素帽，留置针，注射器（规格）。

实验药品：1.5%戊巴比妥钠，2%利多卡因，丁苯诺啡，75%酒精，碘伏，肝素钠（10000U），蒸馏水，生理盐水。

四、实验方法和步骤1.购买SD大鼠，适应性饲养1周，自由饮水，饮食；2.术前禁食12小时；3.称重以1.5%戊巴比妥钠40mg/kg（4%水合氯醛 0.1ml/10g抽取麻药，一般3-5分钟起效，可以维持1小时左右。

），腹腔注射（先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。

），麻醉大鼠，止血钳夹小鼠脚趾确定麻醉深度；4.将大鼠背位固定于手术台上，剪去颈部和腹部被毛；5.取血导管的制备：取PE50导管约15cm，一侧剪契口，另一端平口，对楔面要进行简单打磨处理,以防表面粗糙划破血管外壁。

抗凝处理是将导管用装满肝素钠的注射器灌流、冲洗,保证导管每个部位都充分接触肝素钠。

6.颈静脉置管术：a.用碘伏常规消毒颈部，铺无菌手术单。

b.于胸锁乳突肌连线中点起向颈部垂直延伸15mm,做皮肤切口约1.5cm，暴露皮下结缔组织，用血管钳逐层钝性分离至显露颈静脉(特征是在胸廓入口处，有轻微搏动，直径2～4 mm)，2%利多卡因3-5滴局部浸润1min，完全游离一段长1-1.5cm血管，血管夹分别夹闭远心端和近心端，血管下穿过两根1号线。