呕吐毒素荧光定量检测试纸条

动物生产荧光定量检测试纸检测饲料中呕吐毒素原小燕1，王　虎2，刘映雪2（1.洛阳莱普生信息科技有限公司，河南 洛阳　471000 ；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳　110000）摘要：本研究建立了饲料中呕吐毒素荧光定量检测方法。

饲料样品经70%甲醇溶液提取，过滤后，用0.01M p H7.4P B S复溶,结果表明，呕吐毒素在0.5～8毫克/公斤浓度范围内线性关系良好，r2=0.999。

以配合饲料、浓缩饲料、预混料为添加基质，其回收率在80%～120%，检出限为500p p b。

结论显示,本方法灵敏度高，操作简单，结果准确，可满足饲料中呕吐毒素的分析检测。

关键词：呕吐毒素；饲料；荧光定量检测试纸1　材料与方法1.1　仪器与试剂荧光免疫分析仪(苏州和迈精密仪器有限公司)，XH-C涡旋混合器（新宝仪器有限公司），称量天平（DIGITAL SCALE）。

呕吐毒素单克隆抗体和呕吐毒素半抗原—牛血清白蛋白偶联物，购自武汉优博生物技术有限公司；M E S，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；E D C，购自国药集团；试剂牛血清白蛋白，购自上海生工生物工程有限公司；时间分辨荧光微球，购自上海辉质生物科技有限公司；呕吐毒素及其他真菌毒素的标准品，购自S i g m a公司；硝酸纤维素膜，购自MDI。

1.2　试验方法1.2.1　样本处理方法　称取2.0±0.05克研碎的样本至50毫升离心管中，加入10毫升样本提取液，用振荡器充分振荡5分钟，将振荡后的样本用定量分析滤纸过滤，用样本稀释液将滤液按1∶79比例稀释（例，10微升滤液+790微升样本稀释液），取稀释后液体进行检测(稀释系数400)。

1.2.2　操作步骤　打开荧光免疫分析仪，同时撕开检测试纸铝箔袋，取出检测试纸，放于平整、洁净的台面上。

用配套吸管吸取待检样本，垂直而缓慢的滴加2～3滴（约60微升）到加样孔内。

静置10分钟，上机检测，超过20分钟的结果无效。

分析与检测Tlogy科技54 食品安全导刊 2016年10月林可霉素(Lincomycin)属于林可胺类抗生素，主要用链霉菌发酵得到，对革兰氏阳性菌有较强抗菌作用，对支原体也有抑制作用。

林可霉素对敏感人群副作用较强，可引起消化道反应，如恶心、呕吐等，还可导致过敏反应，如皮疹、荨麻疹、多形性红斑等。

该药物常作为饲料添加剂，预防动物疾病，不规范用药可导致在动物组织、动物产品以及乳品中残留，不仅影响动物性产品的加工生产，而且还会严重影响消费者的身体健康。

农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》(235号公告)规定了林可霉素在牛奶中的最大残留限量为150μg/kg。

针对林可霉素的定量测定国际通用方法为采用仪器方法，仪器方法灵敏度高，但是操作复杂，费用昂贵，需要专门的技术人员进行操作，不宜推广。

因此，急需建立一类准确、快速、简便的林可霉素检测方法。

近几年，虽然胶体金免疫层析技术已经诞生，但由于胶体金标记抗体检测信号的局限性，限制了其方法学的灵敏度。

荧光定量检测系统由于简单快速、即时定量，从而作为一项新的检测方法崭露头角。

方法优势林可霉素荧光定量试纸条是北京维德维康生物技术有限公司自主研制出的荧光定量检测产品之一，根据标准曲线对样品中林可霉素含量进行定量检测，通过建立标准曲线可知，其IC50=28，线性定量范围：20~80ppb，检测限（LOD）为7.8ppb，定量限（LOQ）为20.7ppb。

其标准曲线如图1所示。

将林可霉素荧光定量检测卡与已有的林可霉素胶体金检测卡、试剂盒等产品进行对比，比较其各项指标参数，结果见表1。

通过比较发现，荧光定量检测卡弥补了胶体金无法进行定量检测的不足，在标准曲线内可以进行定量检测，同时具备了较高的灵敏度，为其检测准确度提供了保障。

此外，与试剂盒相比，荧光定量检测卡达到了相同检出限水平，同时，在进行样品前处理时无需稀释处理，使操作变得更便捷。

相比之下，荧光定量检测卡综合了高灵敏度定量检测性能，同时又具备快捷的操作能力，具有显著优势。

呕吐毒素标准操作规程1、目的为了规亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。

2、围本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。

3、检出限和定量限5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。

用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。

5.2 溶液配制5.2.1 PBS缓冲液：称取8.0g 氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至1L。

上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。

5.2.2 呕吐毒素标准工作液：先用色谱级甲醇将高标稀释到5ppm，再用水将其稀释到1ppm，此时标品的溶剂为20%甲醇，然后再用20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。

5.3 样品前处理5.3.1 玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本----将样品粉碎，称取25g样品，加入5g聚乙二醇，加入125mL蒸馏水；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取2.5mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：25.3.2 麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本----称取10g样品，加入100mL蒸馏水；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取5mL上样液过免疫亲和柱净化。

关于小麦粉呕吐毒素（DON）的研究作者：庄巧云，谢卫忠，方晓斌来源：《现代食品》 2017年第5期呕吐毒素（vomitoxin）是普遍存在于粮食作物及其制成品之中的重要污染毒素，该毒素也叫做脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是一种单端孢霉烯族化合物，能够引起动物呕吐等中毒症状，故而称为呕吐毒素。

小麦作为主食作物，是呕吐毒素分布最广的作物之一。

在小麦生产加工的过程中，呕吐毒素伴随着面粉的制成存在于小麦粉中，严重危及人们的身体健康。

因而针对小麦粉呕吐毒素的产生、危害、测定以及消减技术分析，强化小麦粉呕吐毒素认识，提高食品安全意识，降低呕吐毒素危害具有重要意义。

1 呕吐毒素及其危害1.1 呕吐毒素及其分布呕吐毒素作为一种常见的真菌毒素，其典型的化学性质是高度的稳定性以及受热不易分解，在自然界中具有很强的适应性，广泛分布在各种粮谷作物中，在世界范围内普遍存在。

这种呕吐毒素主要是来源于单端孢霉烯族化合物，如尖孢镰刀菌、粉红镰刀菌等，科学研究发现这种单端孢霉烯族毒素约有150 种，这种毒素的各种霉菌极易生长也难以控制，因而对粮谷作物的影响极为严重。

其理化性质也不突出，一般为纯白色结晶，在紫外线照射下也没有荧光，遇水的溶解度较高，而且稳定性较高，遇热也不易分解，因此该种毒素的测定与降解也需要一定的技术支持。

在日常的生活中，呕吐毒素的分布极为广泛，既存在于各种粮谷作物生产与收割之中，如小麦、大麦、玉米等的生长过程中由于久雨造成，也存在于作物储存时潮湿环境下生长的各种霉菌，而作物相关制成品也是呕吐毒素分布的重灾区，危害极大。

1.2 呕吐毒素的危害呕吐毒素之所以受到严格的管理在于其很强的毒性，主要体现在两个方面：①具有细胞毒性。

②具有很强的免疫抑制性。

细胞毒性方面，呕吐毒素能够严重损害原核细胞、真核细胞、植物细胞和肿瘤细胞等。

Prelusky 等研究发现，呕吐毒素可以通过渗透磷脂双层，作用于亚细胞水平；与细胞膜相互作用以及借助自由基介导的脂质过氧化作用等方式对原核细胞进行作用，从而严重损害细胞原有功能。

呕吐毒素定量卡法在小麦及面粉等农副产品中的应用---济南痕量生物科技有限公司一、呕吐毒素介绍：呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是单端孢菌素烯烃中的一种。

作为一种常见的真菌毒素，呕吐毒素在自然界中广泛存在于小麦等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率。

小麦一旦被呕吐毒素产毒霉菌株污染，在适宜生长环境中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。

由于DON的严重影响引起了各国的普遍重视。

美国食品药物管理局规定食品中呕吐毒素安全标准是1000ug/kg,而欧盟制定的限量标准相对较严，谷粉及玉米粉中允许限量750ug/kg 。

我国2013年国家风险监测计划已将小麦和面粉中呕吐毒素含量的检测列为重点。

二、小麦和面粉中呕吐毒素国家残留限量标准大麦、小麦、麦片、小麦粉≤1000ug/kg三、呕吐毒素定量卡的行业标准：LS/T6113-2015《粮油检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法》四、济南痕量生物呕吐毒素定量卡法检测方案近年来，在真菌毒素定性检测条的基础上，国际上推出了真菌毒素快速定量检测条，配合专用的读数仪，可以在十几分钟内完成真菌毒素的快速定量检测，其检测结果与国标仪器方法具有较高的吻合度。

美国Charm公司推出的呕吐毒素定量检测条可在十几分钟内快速定量的检测出大麦、小麦、面粉中呕吐毒素的残留量，样品前处理简单，检测操作简便，结果准确、可靠，准确性符合HPLC法的检测结果，适用于各类小麦收储、面粉加工企业及检测机构。

1、呕吐毒素定量检测试纸条的性能检测灵敏度：0-1.5ppm（稀释的提取物）1-6ppm（二次稀释的提取物）检测限：≤100ppb2、检测所配备的仪器和耗材编号名称数量1 ROSA孵育器（45℃） 1台2 ROSA-M读数仪 1台3 打印机（可选） 1台4 4000转低速离心机 1台5 旋转摇床或漩涡混合仪 1台6 粉碎机（500克） 1台7 天平（感量0.01g) 1台8 50ml/100ml离心管若干9 1.5ml离心管若干10 20目标准筛 1个11 10µl-100µl移液器 1把12 100µl-1000µl移液器 1把3、样品前处理过程：3.1稀释提取物可定量检测0-1.5ppm呕吐毒素称取5g或10g粉碎均匀、过20目标准筛、具有代表性的样品至干净的50ml或100ml 离心管中；加入体积为样品重量5倍的样品提取液（蒸馏水或去离子水）25ml或50ml；剧烈振荡1min，请勿超过2min；静置1min；取上清液1ml至1.5ml离心管中，4000r/min离心1min；取100ul样品提取液至1.5ml离心管中并加入1ml稀释缓冲溶液混匀，得到稀释提取物。

呕吐毒素快速检测试纸条使用说明书【产品简介】脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）又称呕吐毒素（Vomitoxin），本产品为呕吐毒素胶体金快速检测卡，用于定性检测谷物样品中呕吐残留，整个检测过程只需要5分钟，检测卡灵敏度为250ng/ml（2 50ppb）。

谷物样品的检测限为1μg/ml（1ppm）。

【检测原理】基于竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中如果含有呕吐毒素，其浓度又高于检测试纸的灵敏度，则会与试纸卡上的抗体结合形成复合物，使应该在试纸上出现的红色T线不显色，结果判为阳性。

反之为阴性。

【适用范围】快速筛查粮食或饲料中呕吐毒素是否超标以及食物中毒发生后快速筛查中毒因子是否为呕吐毒素。

【包装组成】●呕吐毒素胶体金法检测卡（40份）●一次性塑料滴管（40支）●塑料一次性手套（5只）●使用说明书（1份）【样品处理】1.取5g以上有代表性的粉碎后的谷物样品（过20目筛），准确称取0.5g均匀粉碎试样，加入到配套的15 ml离心管中。

2．向离心管中准确加入纯净水和乙酸乙酯各2mL，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟（备注：如实验室没有大离心机设备，可以用小离心管取1.5ml上清液，用小离心机离心）。

3．用吸管取0.6mL上清液到小玻璃杯中，吹干滤液，然后用0.3ml体积稀释液复溶杯底固体。

此溶解液即为检测液.4．取出试纸，开封后平放在桌面，用滴管向试纸孔缓慢而准确地逐滴加入3滴检测液。

5．5~10分钟判断结果，半小时后的结果判读无效。

【结果判断】阴性（－）：C、T线均显色。

表示样品中不含有待检测物质或其浓度低于检测限。

阳性（＋）：检测T线不显色，则表示样品中待检测物质浓度高于检测限。

无效：质控C线未显色，表明操作过程不正确或试纸条已失效。

【贮存条件及有效期】2-30℃，密封干燥，检测卡保存时间18个月，乙酸乙酯为易挥发性有机溶剂，保存为12个月。

真菌毒素胶体金检测试纸基于抗原抗体的免疫原理，利用纳米胶体金层析技术，在真菌毒素的现场检测时具有以下优势：1) 单个样品即可检测，无需仪器设备，特别适合现场检测；2) 灵敏度高: 免疫层析法可检出量可达ng级，ELISA法最低检出量可达pg级，并可定量测定。

ELISA kit for quantitative detection of deoxynivalenol一、概要呕吐毒素(V omitoxin)，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，化学名称为脱氧腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，容易存在于各种谷物类粮食及加工产品中，污染水平一般为mg/kg（ppm）级。

DON具有很强的细胞毒性。

人误食DON含量高的食物后，容易导致急性中毒头昏、腹胀、恶心、呕吐，以及白细胞缺乏症。

目前通常应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对谷物（小米、玉米、大麦等）及其制品（蛋糕、饼干、面包等）中的DON含量进行快速、定量检测。

二、原理本试剂盒是利用间接酶联免疫吸附微孔模式进行检测，灵敏度可达12.5 µg/kg（ppb）。

样品或标准品中游离的呕吐毒素与包被在微孔中的抗原竞争结合游离单克隆抗体上的结合位点，形成抗原抗体结合物，经洗板洗去多余的抗体与呕吐毒素后，加入酶标记的二抗与单克隆抗体结合，经再次洗板后加入显色剂与反应底物，其与酶标物作用而成蓝色，加入反应停止液后颜色由蓝色转变为黄色，黄色越深则表明呕吐毒素越少，用酶标仪在450 nm处测定光吸收值可准确定量检测样品中的呕吐毒素污染水平。

三、试剂盒构成1、反应板支架…………………………………………………………………………1块2、呕吐毒素抗原包被反应板………………………………………………………….36孔3、呕吐毒素标准品溶液（0 ppb，12.5 ppb，25 ppb，50 ppb，100 ppb，200 ppb）…1套4、呕吐毒素单克隆抗体………………………………………………………1瓶5、稀释液……………………………………………………………………1瓶6、酶标二抗溶液………………………………………………………………1瓶7、显色剂溶液………………………………………………………………………1瓶8、反应底物溶液………………………………………………………………1瓶9、终止液………………………………………………………………………………1瓶10、浓缩洗涤液（20 X）………………………………………………………1瓶四、注意事项1、试剂盒请置放于2-8℃条件下保存，使用过程中不要让微孔干燥，使用后立即将试剂放回至2-8℃条件下冷藏。

小麦中呕吐毒素荧光定量免疫层析快速检测产品评价唐亚娥，王 坛，米 山（铜川市粮油产品质量监督检验站，陕西铜川 727000）摘 要：为在基层检测中更加准确地检出小麦中的呕吐毒素，给予收储单位和贸易商有效的参考，本文选择市场占有率较高的4个呕吐毒素荧光定量免疫层析快速检测厂家，对其进行准确度和精密度评价。

结果表明，4个厂家产品准确度均有回收率超出80%～120%的结果，A厂家高浓度水平检测结果相对标准偏差超出15%，偏差较大不符合粮食收储要求；B、C、D厂家检测结果精密度较好，但存在整体偏低或偏高的风险。

因此各厂家现有产品在收粮现场使用均有瑕疵，各个厂家仍需要进行进一步优化。

关键词：小麦；呕吐毒素；荧光定量；快速检测；产品评价Evaluation of Commercial Fluorescence Quantitative Rapid Test Strips for Detection of Deoxynivalenolin WheatTANG Yae,WANG Tan, MI Shan(Tongchuan Grain and Oil Product Quality Supervision and Inspection Station, Tongchuan 727000, China)Abstract: In order to more accurately detect vomiting toxins in wheat in grassroots testing and provide effective reference for storage units and traders, this article selects four manufacturers with high market share for fluorescence quantitative immunochromatographic rapid detection of vomiting toxins and evaluates their accuracy and precision. The evaluation results show that the accuracy of the products from all four manufacturers has a recovery rate exceeding 80%～120%. The relative standard deviation of the high concentration level detection results from manufacturer A exceeds 15%, which is relatively large and does not meet the requirements for grain storage; the precision of B, C, D manufacturer’s testing results is good, but there is a risk of overall low or high accuracy. Therefore, the existing products of various manufacturers have defects when used at the grain harvesting site, and further optimization is still needed by each manufacturer.Keywords: wheat; deoxynivalenol; fluorescence quantification; quick detection; product evaluation.小麦是我国的主要粮食作物之一，我国2022年小麦产量13 772万t，占全国粮食总产量的20.06%。

饲料中呕吐毒素（DON）荧光定量8min快速检测系统，国粮局权威验证一、呕吐毒素危害及检测方法介绍呕吐毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在于小麦等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率，小麦一旦被呕吐毒素产毒菌株污染，在适宜生长环境（水分活度Aw>0. 87）中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。

我国2013 年国家风险监测计划已将小麦和面粉中呕吐毒素含量的监测列为重点。

目前呕吐毒素的检测方法主要分为两大类：即确认方法和快速方法。

确认方法主要基于理化仪器设备，如薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)和各种联用技术如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)等；快速方法主要是基于免疫化学基础上的免疫分析方法如免疫亲合柱-荧光检测(IAC-FLD)、酶联免疫吸附法(ELlSA)和胶体金免疫层析法等。

结果准确、法定认可是理化方法最大的优点，但是仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，成本极高，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测，一般仅用于最终的确证。

酶联免疫吸附法ELISA 方法和胶体金快速检测卡是企业常用的快速检测方法，但也均存在各自的优缺点：ELISA 方法能灵敏度相对较高，且能定量检测，但操作过程相对复杂，对环境和人员要求高，环境干扰因素复杂，重复性较差；胶体金检测卡可以满足现场快速的要求，能在5-10min内快速测定，但是只能定性，且灵敏度较低，肉眼观察主观性较强，重复性差。

二、饲料中呕吐毒素国家残留限量标准引自：《GB 137078-2017 饲料卫生标准》。

三、上海飞测饲料中呕吐毒素荧光定量快速检测系统上海飞测生物基于全球领先的荧光定量FPOCT技术平台，开发了呕吐毒素荧光定量快速检测系统，该系统结合了胶体金快速、酶联免疫定量以及色谱法准确的特点，可在8min内快速准确定量的测定出饲料中的呕吐毒素的含量，样品前处理简单（仅需7min），操作简便，只需一步加样，无需标准品，无需做标准曲线，采用荧光免疫定量分析仪读数，结果准确可靠且可现场打印，准确性高度符合HPLC法的检测结果，为呕吐毒素的快速检测和控制提供了一种全新的技术手段，适用于各类饲料加工企业、检测机构及政府相关监管部门。