食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法

挪I分析与检测胶体金免疫层析技术快速检测谷物中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素□贺丽丽拜发分析系统销售（北京）有限公司1971 年，Faulk 和 Taylor 首次将胶体金引入免疫化学领域，建立了 以胶体金标记抗原（或抗体）检测相 应抗体（或抗原）的免疫学新方法。

自此，胶体金标记技术成为继荧光标 记、酶标记和放射性免疫标记之后的 又一新型免疫标记技术〇经过近50年的 发展，免疫胶体金标记技术已较为成 熟，并被广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀及蛋白质 染色技术中。

此外，这一技术还被引 进免疫诊断/检测领域，并在医学检验、植物学诊断、刑侦、食品安全检测方面应用广泛。

德国拜发生产的 RIDA®QUICK系列就是利用胶体金免疫层析原理制备成胶体金免疫层析横流检测卡，结合德拜发集团独有的RIDA®SM ARTAPP读数仪，能对食品中存在的霉菌毒素进行准确定量检测。

本文通过实验对德国拜发集团生产的RIDA®QUICK霉菌毒素系列在谷物、花生及花生粗榨油中的检测应用进行客观评价。

1材料与方法1.1材料RIDA®QUICK Aflatoxin RQSvRIDA®QUICK Zearalenon RQS、RIDA®QUICK DON 及 RIDA®SMART APP读数仪，均由德国拜发集团提供；用于添加回收实验的标准品为Trilogy®标准品，用于验证实验过程的参考物质为Tri丨ogy®参考物质；用于配合HPLC高效液相色谱使用并进行比对试验的霉菌毒素免疫亲和柱为EASI-EXTRACT®A F L A T O X IN、E A S I-E X T R A C T®ZEARALENONE、D0NPREP®。

以上所有材料均由德国拜发集团生产，购买自拜发分析系统销售（北京）有限公司。

质量安全粮油食品科技第25卷2017年第3期胶体金快速试纸条法测定小麦及其制品中呕吐毒素朱云1，徐琳娜1，师征杰2，沈静怡2，李秀林1(1.苏州市粮油质量监测所，江苏苏州215007;.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215006)摘要：用胶体金快速试纸条法测定小麦及其制品中呕吐毒素，方法快速，定量结果较为准确，回收 率在86.67 %~ 120 %。

与高效液相法进行比较，结果表明这2种方法对呕吐毒素的检测没有显著的差异，其回收率略高于高效液相法，但变异系数大。

在较低浓度（<1 500网/kg)时，快速法与高 效液相法有一定的线性关系F= 1.077 3尤+ 83.786( r为胶体金快速法测得值，Z为高效液相法测 得值，R2 =0.963 7)。

关键词：胶体金；快速定量;呕吐毒素；高效液相法;相关性中图分类号:TS 207.3文献标识码:A文章编号=1007 -7561 (2017)03 -0054 -03Rapid determination of deoxynivalenol in wheat and itsproducts by colloidal gold stripesZ H U Y u n1, X U Lin - na1, SHI Zheng -jie2, S H E N Jing - yi2, LI Xiu - lin1(1. Suzhou Cereals and Oil Quality Supervision and Inspection Institute, Suzhou Jiangsu 215007;2. School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou Jiangsu 215006)Abstract ：Determination of deoxynivalenol (D O N)in wheat and i t s products by colloidal gold s t r i p s was very f a s t and accurate.I t s recovery rate was between 86.67% 〜120%. Compared with the HPL C method, the results showed that there was no significant difference between the two methods in the detection ofD O N.The recovery rate was a l i t t l e higher than H P L C.But the coefficient of variation was bigger.At lowconcentrations ( <1 500 ^g/kg), the rapid method had a linear relationship with the standard method： Y=1.0773X+83.786 (Y represent the r e s u l t by rapid method,X represent by HPLC method, R2=0.963 7).Key words ：colloidal gold stripes; rapid quantification ； deoxynivalenol (D O N) ; high performance liquid chromatography (H P L C); r e l a t i v i t y脱氧雪腐镰刀條醇（deoxynivalenol,D O N)俗称 呕吐毒素，是源于镰刀菌属产生的单端孢霉烯族化合物。

谢婷婷，林秀，陈凌峰：小麦中呕吐毒素快速检测方法比较小麦中呕吐毒素快速检测方法比较*谢婷婷，林秀，陈凌峰(福建省粮油质量监测所，福建福州350012 )摘要：以小麦为原料，采用酶联免疫吸附法、肢体金快速定量法、时间分辨荧光免疫层析法及高效液相色谱法 检测其呕吐毒素含量并探讨3种快速检测方法的准确性。

结果表明，上述3种快速检测方法均适用于小麦中呕吐毒 素的检测，且具有准确性高、快速、简单、便携等特点。

关键词：呕吐毒素；酶联免疫法；肢体金快速定量法；时间分辨荧光免疫层析法；液相色谱法doi：10.3969/j.issn.l007-550X.2018.09.003中图分类号：TS210.7 文献标识码：A文章编号：1007-550X(2018 ) 09-0020-05目前，基于大型仪器的检测方法，由于仪器不 具有便携性、样品前处理操作比较复杂、检测需要 的时间较长、检测成本较高等原因无法满足短时间 内得出实验结果和现场快速检测的需求。

快速检测 方法与大型仪器方法相比，是一种能够将样品前处 理简化以及短时间内能对相关的质量安全指标得出 检测结果的技术[1]。

近年来，粮食中真菌毒素的危害性受到广泛关 注，其检测方法也越来越受到重视。

呕吐毒素(vomitoxm)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（D O N)，它是一种由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，主要污 染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物[2]。

粮食中呕吐毒素快速检测方法有酶联免疫吸附 筛查法、胶体金决速定量法和时间分辨免疫层析法。

酶联免疫吸附法(ELISA法)是把抗原和抗体的特异性 免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测 技术[3]也是国标规定的筛查方法[4]。

胶体金快速定量 法是以胶体金层析免疫竞争为原理，以小分子化合 物为检测对象，运用侧流技术发展起来的一种真菌 毒素快速检测方法[5—7]，它具有检测速度更快、检测 成本较低，操作更简单等优点。

时间分辨免疫层析法(time—resolved fluoroimmunoassay，T R FIA)是禾lj 用真菌毒素与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反 应，用时间分辨荧光免疫层析检测仪测定反应产物 中的荧光强度，前期的研究结果已证实该检测方法 可行[8]。

食品检测FOOD INSPECTION食品安全问题一直是国家和社会关注的重点问题，因此，相关部门一定要高度重视食品安全检测，并注重新技术的引入，比如胶体金免疫层析技术。

胶体金免疫层析技术可以有效发挥食品检测的作用，更好地保障食品安全，提高人们的生活质量，促进社会的稳定发展。

一、胶体金及免疫层析技术的含义1.胶体金技术。

胶体金技术是指氯金酸在某种环境下的一种变化反应而形成的胶体溶液。

其反应过程首先要用的是还原剂，通常有白磷和柠檬酸钠等，在其作用下将氯金酸按相关要求聚合成固定大小的金颗粒，然后再由静电作用将其凝聚成稳定的胶体溶液。

胶体状态下的金颗粒具有高电子密度的特性，其密度一般能达到107个/mm2，呈圆形的斑点，颜色一般为粉红色，其大小肉眼刚好可见，在检测中常用作一种标记物，对实验结果的影响十分重大。

2.免疫层析技术。

免疫层析技术是一种免疫分析技术，主要是根据抗原和抗体的反应来进行检测。

通常包括两大类，一类是非竞争性免疫层析，一类是竞争性免疫层析。

非竞争性免疫层析技术主要针对一些大分子蛋白质的检测。

首先，将采用胶体金标记后的样品与等待检测抗原中的特异性抗体进行结合，这两类物质结合后会出现沉淀现象，此时需要注意将其沉积物放到结合区域中。

其次，将待检测的样品材料放到样品区位置，再利用毛细管将样品与结合区进行完全融合，其中，带有胶体金标记的样品材料会由于受到张力的作用而不断地向前移动。

此时，样品中已经存在的抗原物质便会自动与带有胶体金标记的样品相互结合，形成一种结合体物质。

紧接着，样品溶液会进行固相化，并在通过固相化后的第一层防线时将含有结合体物质抗体材料进行捕获，然后形成新的结合体复合物材料。

那些没有结合体材料的物质不会被捕获，它们会继续向前移动，然后那些结合体在通过下一道防线时会与另一种抗体结合，形成第三种结合体复合材料。

竞争性免疫层析技术主要针对一些单一抗原的小分子抗原适用，比如兽药残留的检测等。

胶体金免疫层析法在食品快速检测中的应用研究进展谢桂芳，赖　飞，王艺蓉，周雪丽，王晓鹭，蔡　滔*（贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州贵阳 550001）摘　要：近年来，随着城市化进程加快，各类食品流通更为频繁，食品安全问题日益凸显,人们越来越关注食品安全，而准确、快速的检测方法是保证食品安全的重要手段。

本文介绍了胶体金免疫层析技术的基本原理和制备方法，并概述了其在检测食品中农药残留、霉菌毒素、食源性致病菌、重金属和非法添加剂等方面的应用及前景，为我国食品安全快速定量检测技术提供思路方法。

关键词：胶体金免疫层析技术；食品安全；快速检测The Progress of the Application of Colloidal GoldImmunochromatography in Rapid Food DetectionXIE Guifang, LAI Fei, WANG Yirong, ZHOU Xueli, WANG Xiaolu, CAI Tao* (Guizhou Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing Center, Guiyang 550001, China) Abstract: In recent years, with the acceleration of urbanization, the circulation of various foods has become more frequent, and food safety issues have become increasingly prominent. People are paying more and more attention to food safety, and accurate and rapid detection methods are important means to ensure food safety. This paper introduces the basic principle and preparation method of colloidal gold immunochromatography technology, and outlines its application and prospects in the detection of pesticide residues, mycotoxins, foodborne pathogens, heavy metals, and illegal additives in food, providing ideas and methods for rapid quantitative detection of food safety in China.Keywords: colloidal gold immunochromatographic technology; food safety; rapidly detection近年来，食品安全事件频发，食品安全问题也受到了社会的高度关注。

胶体金免疫层析技术在食品安全现场快速检测中的应用
胶体金免疫层析技术是一种广泛应用于食品安全现场快速检测和生物医学检测中的一
种技术。

其基本原理为利用金纳米颗粒在光的作用下的特殊颜色散射和吸收特性，将其与
特定抗原或抗体结合在一起，进行零点检测，从而达到快速、准确、高灵敏度的检测结
果。

胶体金免疫层析技术主要包括样品浸润、检测剂涂布和读取结果三个步骤。

具体操作
步骤如下：
1. 样品浸润：将待检样品加入相应的稀释液中，使其浓度与检测要求相适应；
2. 检测剂涂布：将样品与特定的抗体或抗原结合的检测试剂涂布在检测纸条上；
3. 读取结果：在检测纸条上读取检测结果，通常是根据纸条颜色的变化判定结果
的。

胶体金免疫层析技术主要适用于病原体、重金属元素、农药、兽药、抗生素等食品安
全检测领域。

例如，在肉制品中被检测到的三联磷等药物残留的检测中，胶体金免疫层析
技术可以实现快速、定性、定量的检测，准确率高、检测时间短。

此外，在海产品、蟹类、鱼类等贝类食品中检测常见的福尔马林、二氧化硫等物质的残留，以往需要一天时间的检
测时间，而应用胶体金免疫层析技术则能将其缩短至1小时以内。

相比于传统的检测方法，胶体金免疫层析技术具有快速、准确、低成本、易操作等优点。

但是，由于技术门槛较高、适用的样品范围有限等因素限制了其在实际应用中的推广。

在今后的食品安全检测中，需要进一步完善胶体金免疫层析技术的性能和准确率，以满足
不同领域和不同样品类型的检测需要。

赤霉病麦〔呕吐毒素〕中毒呕吐毒素的快速检测
1 适用范围：快速筛查粮食或饲料中呕吐毒素是否超标以及食物中毒发生后快速筛查中毒因子是否为呕吐毒素。

2 检测原理：基于竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中如果含有呕吐毒素，其浓度又高于检测试纸的灵敏度，那么会与试纸卡上的抗体结合形成复合物，使应该在试纸上出现的红色T线不显色，结果判为阳性。

反之为阴性。

3 灵敏度：100L常量稀释液，用力振荡2分钟。

静置或离心得到样品上清液。

5测试步骤：取出测试卡，开封后平放在桌面，用滴管逐滴参加3滴样品提取液于测试卡椭圆形孔中，如到30秒时在长方形观测窗中无液体移行，可补加1滴样液，在5～10分钟内判断结果。

6 结果判断
阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸均判为无效。

7 备注与考前须知
所有试纸启封后1小时内使用。

本品为一次性产品，请勿重复使用；请勿使用非本品随附的稀释液。

本品为筛选试剂，任何可疑结果请用其它方法作进一步确认。

8 产品包装：试纸卡5片，2021缩稀释液1瓶，15mL离心管1支〔清洗后可反复使用〕。

9 产品保存：4～30℃阴凉枯燥处保存，不可冷冻，防止阳光直晒，有效期18个月。

呕吐毒素在小麦及面粉等农副产品中的检测方法呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是单端孢菌素烯烃中的一种。

作为一种常见的真菌毒素，呕吐毒素在自然界中广泛存在于小麦等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率。

小麦一旦被呕吐毒素产毒霉菌株污染，在适宜生长环境(水分活度Aw>0.87)中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。

呕吐毒素属于剧毒或中等毒物，对人有很强的毒性，当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。

由于DON的严重影响引起了各国的普遍重视。

美国食品药物管理局规定食品中呕吐毒素安全标准是1000ug/kg,而欧盟制定的限量标准相对较严，谷粉及玉米粉中允许限量750ug/kg 。

我国2013年国家风险监测计划已将小麦和面粉中呕吐毒素含量的检测列为重点。

呕吐毒素的检测标准1、大麦、小麦、麦片、小麦粉≤1000ug/kg2、玉米、玉米面（渣、片）≤1000ug/kg3、大米、小米、高粱米、大麦米、黍米≤1000ug/kg4、米粉、汤圆粉、面条、饺子皮、馄钝皮、烧麦皮、面糊、面筋、八宝粥罐头≤1000ug/kg呕吐毒素检测方法的国标（1）GB/T23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》（2）GB/T5009.111-2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》第二法免疫测定法（ELISA)呕吐毒素检测方法的行标LS/T6113-2015《粮油检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法》呕吐毒素商检推荐行业标准SN/T《1571-2005进出口粮谷中呕吐毒素检验方法液相色谱法》测定呕吐毒素的常用方法如：济南痕量生物提供的胶体金定性卡法、酶联免疫吸附测定法、免疫亲和柱高效液相色谱法、胶体金定量卡法。

食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法1 范围本方法规定了胶体金免疫层析法测定食品中呕吐毒素的快速检测方法。

本方法的适用范围为谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速检测。

2 原理试样中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色发生变化，根据检测线颜色变化进行结果判定。

3试剂及耗材除非另有规定，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中三级水。

3.1 试剂3.1.1 提取液：水或胶体金免疫层析检测装置专用提取液。

3.1.2 甲醇：分析纯3.2 参考物质呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。

表1 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量注：或等同可溯源物质。

3.3 标准溶液配制准确称取适量的呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存，有效期3个月。

3.4 材料3.4.1 呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置。

3.4.2 中速定性滤纸。

3.4.3 离心管。

3.4.4 滤膜：0.45 µm 水相滤膜。

4 仪器及设备4.1 天平：感量0.01～0.0001 g。

4.2 粉碎机。

4.3 样品筛：0.9 mm。

4.4 漩涡混合器：1500 rpm/min。

4.5 移液器：100 μL，200 μL，1.0 mL。

4.6 恒温装置：（37.0±2.0）℃。

4.7 设备或方法使用环境条件：温度15 ℃～30 ℃，湿度≤80%。

5 分析步骤5.1 扦样和分样，按GB 5491 执行。

5.2 试样制备5.2.1 样品粉碎：将被测样品（5.1）粉碎，过0.9 mm样品筛，充分混合均匀，备用。

5.2.2 质控样品制备：选取经标准方法确认不含呕吐毒素的样品，称取2份平行样，其中一份作为阴性质控样品，另一份添加标准溶液使其样品中呕吐毒素含量为1.0 mg/kg，作为阳性质控样品。

胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用近年来，食品安全问题始终是人们关心的焦点问题，要想高效保证食品质量，提升生活水平，一定要对食品安全剖析检查工作给予高度关注，在此环境下，大量食品安全剖析监测技术纷纷被研制出来，且在实践中被广泛运用，胶体金免疫层析技术便是其中的一种，具备操纵简易、剖析明确、容易鉴别等优势。

胶体金免疫层析技术剖析的定义对于胶体金来说，具体是指在氯金酸溶液的还原剂促进下，生成一定尺寸的金颗粒，而且在静电影响下形成相应的胶体溶液。

这些金颗粒具备较大的电子密度，聚合成相应密度以后便能通过肉眼发现有粉红色的斑点存在，能将其当做免疫层析实验的指示物。

在使用胶体金免疫层析技术的过程中，一定要把特殊性抗体或者抗原牢固在膜中，通过毛细作用让样品在层析条上运动，进而让其和受体产生免疫反应。

但在此进程中，免疫复合物会被阻挡在监测带之内，因此能一目了然的观察实验结果。

在检查食品时，使用此项技术可以实现药物、病菌、毒素以及蛋白质等不同物质的检查，而且具备资金投入少、反应迅速、薄弱交叉反应性的优点。

胶体免疫层析技术在食品检测中的运用此技术最初被运用在医学行业中，且被大范围的推行，利用率较高。

最近几年才被运用在食品测定作业中展开食品检查。

在食品监测领域中此项技术的运用重点有两方面，一方面是食品质量的检查；另一方面则是食品安全的检查，进而符合现代人对食品监测的要求。

所以，一定要加强此技术在食品监测中的利用探究，让其良好的推动食品监测技术的提升。

在食品质量方面的运用。

人们在日常生活中时常触及到的食品类型主要有面食、水果、肉、蔬菜等，然而不管是何种食品，其重点的构成成分依然是糖、维生素、脂肪、矿物质、蛋白质等一些人体所需要的养分物质，其几乎归属高分子有机物质，能利用免疫学手段展开物质检查，此种检查只要进行半定量剖析即可，而利用胶体金免疫层析技术便可高效的对食品物质展开检查，迅速准确的获得最后结果，符合检查标准。

比如：奶牛在常规生产之后最开始几天都生产牛初乳，具备较多的有利元素，营养非常高。