生物素-亲合素放大技术

第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。

生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。

生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。

一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。

（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。

BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。

从而使蛋白质标记上生物素。

（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。

BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。

（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。

2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。

2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。

第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。

二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。

（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。

（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。

标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。

2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。

3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。

亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。

四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。

生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。

如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。

计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。

加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。

如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的'吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。

常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。

这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。

免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。

免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。

另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。

一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。

目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。

该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。

主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。

ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。

ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。

由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。

因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。

①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。

生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性。

生物素的理化性质与标记亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记生物素-亲和素系统的特点生物素-亲和素系统的应用生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。

活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。

包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。

常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。

2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。

可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。

3.BNHS和BHZ 二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。

生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。

生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。

生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

（二）标记注意事项1.选择正确的活化生物素和反应条件；2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；3.可在生物素与被标志物间加入交联臂样结构；4.不影响被标记物的免疫活性。

亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物亲和素的天然特异性结合物。

而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。

生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统（Biotin-Avidin Amplification System）是免疫组织化学技术中常用的增强方法。

其原理是生物素与链霉亲和素（Avidin）结合后形成生物素-链霉亲和素复合物，生物素-链霉亲和素复合物与连接荧光素等物质的新化学实体进一步增强了检测灵敏度。

在该系统中，样品经过初级抗体与标记试剂（如酶标记抗体或荧光标记抗体）结合后，再加上与标记试剂相称的生物素化二抗，使生物素化二抗与标记试剂结合。

最后，加入与生物素结合的标记试剂（如辣根过氧化物酶（HRP）偶联的荧光素）来检测目标分子。

这种方法在检测抗原、蛋白质、核酸等方面具有广泛应用。

生物素-亲合素系统生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。

随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。

生物素亲合素系统1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。

1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。

近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。

生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。

BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

BAS用于检测的基本方法可分为三大类。

第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。

第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。

第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。

尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。

特别是其中的BA法和ABC法用得较多。

至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。

BAELISA原理BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。

亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。