亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------常见的生化检测方法Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物，通过抗体与附着于固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。

Western Blot 既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定靶蛋白表达的最方便也是最通用的方法。

1、试剂耗材的准备：⑴、转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037% SDS， 20%甲醇）：⑵、 10丽春红染液：⑶、 TBS 缓冲液：⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液）：⑸、封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：⑹、一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或 TBST 进行稀释。

⑺、底物显色液 ECL，4℃ 避光保存，现用现配。

⑻、显影液和定影液。

用水稀释 10-20 倍于铝盒中，可多次使用。

室温避光存放。

2、实验步骤：⑴、蛋白样品制备：1 / 15用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

⑵、取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。

⑶、转膜：（转膜缓冲液4℃预冷备用，冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。

⑷、将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

⑸、戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中约 15 sec，直到膜变半透明。

用纯水冲洗膜2 次。

浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

⑹、 SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。

亲和素和生物素：两种重要的生物学试剂一、亲和素亲和素是一种重要的生物学试剂，它是一种结合蛋白质的小分子化合物。

亲和素可以通过特定的化学反应与蛋白质结合，从而用于分离、纯化和检测蛋白质。

亲和素的结合能力基于亲和素与蛋白质之间的特异性相互作用，这种相互作用可以形成强大的结合力。

亲和素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 分离和纯化蛋白质：亲和素可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。

2. 检测蛋白质：亲和素可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。

3. 蛋白质互作研究：亲和素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。

二、生物素生物素是一种水溶性维生素，也是一种重要的生物学试剂。

生物素可以与亲和素结合，形成亲和素-生物素复合物，从而实现对蛋白质的分离、纯化和检测。

生物素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 蛋白质标记：生物素可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。

这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。

2. 细胞标记：生物素可以用于将生物素结合在细胞表面上，从而实现对细胞的标记。

这种标记可以用于研究细胞的生理和病理过程。

3. 蛋白质互作研究：生物素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。

三、亲和素和生物素的结合亲和素和生物素的结合是一种特殊的相互作用，它可以形成亲和素-生物素复合物。

这种复合物在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 亲和素-生物素标记法：亲和素和生物素的结合可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。

这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。

2. 亲和素-生物素分离法：亲和素和生物素的结合可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。

生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。

这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。

在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。

首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。

其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。

生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。

在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。

在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。

总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。

麻疹病毒（MLs）IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明（96T/48T）[原理]本试剂盒采用亲和素-生物素化麻疹病毒抗原预包被板ELISA 原理，检测人血清/血浆中存在的麻疹病毒IgM 抗体，并配以酶标记抗人IgM单克隆抗体作为标记物。

加入底物TMB显色后终止反应，在450nm波长测各孔O.D值，O.D值的大小与待检抗体含量成正比。

生物素系统（biotin-avidin system）的稳固级联放大作用，使试剂的特异性、灵敏度、稳定性极大地提高。

另外，血清/血浆经预吸收后非特异性因素（如RF因子和变性或聚合的人IgG）的影响被彻底消除，经验证其结果完全等同于capture-ELISA，为本试剂盒之独特点。

[用途]麻疹是是传染性很强的急性呼吸道疾病，其并发症常见为下呼吸道感染、巨细胞间质肺炎及神经系统慢性进行性疾病-亚急性硬化性全脑炎（SSPE）等。

本试剂盒用于定性检测人血清/血浆中的麻疹病毒早期IgM型抗体，对早期和原发性感染的诊断具有重要价值。

适应范围：麻疹的早期诊断和筛查。

易感人群和高发地区的监查。

[试剂盒组成]1、生物素化抗原预包被板1块（8X12/4X12）2、阴性对照血清1瓶3、阳性对照血清1瓶4、标本稀释液（含抗干扰因子）1瓶（20 ml/10ml，直接使用）5、酶结合物1瓶（12/5ml，直接使用）6、30X浓缩洗液1瓶（20/10ml，加蒸馏水1：30稀释使用）7、显示剂A、B液各1瓶（5/3ml）8、终止液（2M H2SO4）1瓶（5/3ml）9、说明书1份[操作步骤]将试剂盒平衡至室温后取出反应板拆封后置于板架上。

1、样本稀释：用标本稀释液以1：101（5ul—500ul）稀释标本，混匀后置37℃20分钟。

2、加样：小心吸取已稀释待检标本上清液100ul于反应孔中，设阴、阳性对照（各100ul）及空白对照（加100ul标本稀释液）各一孔。

轻拍混匀。

3、37℃温育30分钟。

实验步骤1.开始ELISA前一天，稀释包被抗体，取酶标板每孔加入100ul包被抗体溶液，4度过夜2.使用前将所有试剂放置室温，强烈建议所有标准品和样品做复孔或三孔，各次检测均要求做标准曲线3.洗涤液不少于300ul洗板4次，并在吸水纸上拍干板子，后续洗涤液同此4.为了阻断非特异性结合和减少背景，每孔加200ul样品稀释液5.封板并在摇床上室温孵育1h6.在上述期间，准备标准品稀释液和适当的样品稀释液（如必需）7.标准品稀释：500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml,62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.6 pg/ml,7.8pg/ml 和0 pg/ml8.如步骤3洗板4次9.每孔加入100ul标准品稀释液和样品到对应孔，如有需要可对样品进行稀释10.封板并在摇床上室温孵育2h11.如步骤3洗板4次12.每孔加入100ul已稀释的二抗，封板并在摇床上室温孵育1h13.如步骤3洗板4次14.每孔加入100ul 稀释的HRP，封板并在摇床上室温孵育30min15.如步骤3洗板5次，每次洗涤洗涤液浸泡30s至1min，有利于减少背景16.每孔加入100ulTMB显色液，并在摇床孵育15-30min，阳性孔将变为淡蓝色，此步无需封板17.每孔加入100ul终止液终止反应，阳性孔将由蓝色变为黄色18.终止反应半小时内测定OD值（450nm）ELISA实验基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.0的碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELIS A）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。

洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。