月月桂 AACT 基因的 cDNA 全长克隆及生物信息学分析

园林植物与观赏园艺专业毕业论文 [精品论文] cDNA-AFLP技术分离桂花香气相关基因关键词：cDNA-AFLP 技术分离桂花香气相关基因摘要：桂花(OsmanthusFragrans)是木犀科木犀属的代表种，是优良的园林绿化树种和香花树种。

本研究以桂花的花蕾为材料，运用cDNA-AFLP技术，分离桂花花香形成过程中差异片段，通过克隆测序，BLAST分析，获得的6个可能与香味相关的基因片段，为下一步揭示桂花香味物质代谢途径奠定基础，希望为花卉香味的遗传改良提供一条新途径，主要试验结果如下： 1建立适合桂花花蕾总RNA的提取技术体系采用改良热硼酸法，改良 Tris-硼酸法，试剂盒提取桂花花蕾总RNA，比较结果显示试剂盒法提取的总KNA，条带完整，质量好，纯度高，适合开展试验。

2利用cDNA-AFLP技术分离桂花花香形成过程中差异基因采用末端两个选择性碱基的16条EcoRⅠ引物和16条MseⅠ进行选择性扩增，共256对引物组，通过筛选，确定160对引物组进行扩增。

试验共回收差异条带100带，获得50条测序结果。

在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现有31条序列在nr库中搜索到相似性较高的基因。

另外17条序列没有搜索到同源序列，推测为未知基因。

分析显示31个TDFs中6个TDFs可能与植物香气成分相关，分别命名为20Gox2，C4H1，CCD4，AACT，CFAT，LOX。

3采用RT-PCR 技术分离CFAT和LOX的3'端序列选取其中两个可能与桂花香气相关基因片段CFAT和LOX，设计引物，采用RT-PCR技术扩增其3'端序列，分别进行克隆、测序和拼接，获得了CFAT3'末端，共862bp，LOX3'末端，共1588bp。

本研究将为进一步研究桂花花香相关物质的代谢途径，以及为花卉香味的遗传改良奠定基础。

园艺学报，2016，43 (3)：525–537.Acta Horticulturae Sinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0625；http：//www. ahs. ac. cn 525桂花C4H基因的克隆与表达特性分析曾祥玲，郑日如，罗靖，王彩云*（华中农业大学，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）摘 要：利用转录组测序获得的表达序列信息，结合RACE技术，从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。

其ORF全长分别为1518 bp和1611 bp，各自编码505和536个氨基酸，命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。

系统进化树表明，Of C4H1与矮牵牛中的Ph C4H1、Ph C4H2等C4H蛋白聚为一类，属于ClassⅠ类型；Of C4H2与金银花中的Lj C4H等属于ClassⅡ类型。

进一步的C4H蛋白序列多重比较发现，Of C4H1和Of C4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域，在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。

利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式，结果显示，OfC4H1在花瓣中的表达量最高；OfC4H2在花瓣中的表达量较低，在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。

构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs，转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明，目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达，而且与预期大小一致，但因溶解度较低无法进行酶活性分析。

关键词：桂花；肉桂酸4–羟基化酶；黄酮类化合物；原核表达；基因表达中图分类号：S 685.13 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0525-13 Cloning and Characterization of Cinnamate 4-hydroxylase（C4H）Genes from Osmanthus fragransZENG Xiang-ling，ZHENG Ri-ru，LUO Jing，and WANG Cai-yun*（Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）Abstract：According to the expressed sequence tags from transcriptome assembly and RACE method，two cinnamate 4-hydroxylase genes，which are the second key enzymes involving in phenylpropanoid biosynthesis，were obtained from petals of Osmanthus fragrans. The ORF of these two C4H genes were separately 1 518 bp and 1 611 bp，encoded 505 and 536 amino acids and named OfC4H1（GenBank No. KR861466）and OfC4H2（GenBank No. KF254842）. Phylogenetic analysis showed that Of C4H1 protein was clustered together with Petunia hybrida C4H1 and C4H2，and belonged to ClassⅠtype，whereas Of C4H2 protein was clustered with Lonicera japonica C4H in ClassⅡtype. Multi-alignment of Of C4Hs proteins of several plants found that Of C4H1 and Of C4H2 had the characteristic conservative domains of the C4H family，and special conserved domains which were different in ClassⅠand ClassⅡ C4H. The results of time and space expression patterns by real-time PCR收稿日期：2016–01–15；修回日期：2016–03–21基金项目：教育部博士点基金项目（20130146110022）；黄冈师范学院项目（2015TD02）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：wangcy@）Zeng Xiang-ling，Zheng Ri-ru，Luo Jing，Wang Cai-yun.Cloning and characterization of cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes from Osmanthus fragrans. 526Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：525–537. showed that OfC4H1 had the highest amount of expression in the petals. While OfC4H2 displayed higher expression in green tissues including peduncles，pistils and young leaves，comparing to petals. By constructing prokaryotic expression vector pET6xHN-C4H1 and pET6xHN-C4H2，and transforming into Escherichia coli Transetta（DE3），the result showed that the target proteins can be well expressed in the prokaryotic expression system，and consistent with the expected size，but unable to enzyme activity analysis due to the low solubility of the recombinant proteins.Key words：Osmanthus fragrans；cinnamate 4-hydroxylase；flavonoid compound；prokaryotic expression；gene expression桂花（Osmanthus fragrans）具有很高的观赏价值，食用价值和药用价值。

月季RhMAX2A基因的克隆与表达分析李莎莎;杜高齐;李雪娇;关文灵;孟静【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2024(39)2【摘要】【目的】克隆月季(Rosa hybrida L.)RhMAX2A基因c DNA序列,分析其序列特征及其在不同组织中和去顶后的表达情况,为探究该基因在月季中的生物学功能及调控侧枝发生的转导机制提供理论支持。

【方法】以月季品种滇红(Rosa hybrida‘Dianhong’)为材料,通过RT-PCR技术克隆RhMAX2基因的cDNA序列,利用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白质进行分析,利用烟草(Nicotiana tabacum)瞬时转化技术分析蛋白的亚细胞定位,同时采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在不同组织中及去顶后的表达情况。

【结果】RhMAX2A基因(GeneBank登录号为OP055810)cDNA序列长1030 bp,编码246个氨基酸,该蛋白分子式为C_(2910)H_(4793)N_(1029)O_(1244)S_(210),相对分子质量为27.35 kD,总原子量为3909;该蛋白不稳定系数为53.07,脂肪系数为106.30,GRAVY值为0.049,是一类不稳定亲水性蛋白;RhMAX2A蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,且RhMAX2A为推定的F-box结构域,属于α/β水解酶家族。

同源序列比对和系统进化树关系分析结果表明,RhMAX2A氨基酸序列(OP055810)与同属的古老月季品种月月粉(Rosa chinensis‘Old Blush’)氨基酸序列(XP_024283944.1)相似性最高,其次是同亚科的草莓(Fragria vescasubsp.vesca)(XP_004287076.1),三者亲缘关系较近。

亚细胞定位结果显示,RhMAX2A编码蛋白位于细胞核。

qRT-PCR检测结果显示,RhMAX2A基因在根、腋芽和节中表达,根中表达量最高,去顶处理显著上调RhMAX2A基因在根和腋芽中的表达。

茶树过氧化氢酶基因CsCAT1克隆与生物信息学分析王仲;赖钟雄;郭玉琼【摘要】为了解茶树过氧化氢酶（ CAT）基因的相关信息，以茶树叶片为原始材料，克隆获得茶树CsCAT基因全长，并进行生物信息学分析。

结果表明：茶树CsCAT基因cDNA全长1682 bp，完整的开放阅读框（ORF）长度为1479 bp，共编码492个氨基酸。

生物信息学分析显示：CAT蛋白分子量为56�81kD，理论等电点（ pI）6�78，总平均疏水系数为－0�546，预测亚细胞定位于过氧化物酶体，为稳定的酸性亲水蛋白。

茶树CAT氨基酸序列与棉花、毛果杨、胡麻的相似性分别为93％、92％、91％。

%In order to know about genes of teatree catalase, a CsCAT gene was cloned and analyzed bio-informatically using leaves of tea trees. The results show that the length of CsCAT gene cDNA is 1 682 bp, the complete length of open read frame ( ORF) is 1 479 bp, encoding 492 amino acids. Bioinformatics analysis shows that the protein molecular mass is 56.81 kD, isoelectric point ( pI) is 6.78, and total average dewatering coefficient is -0.546. It is estimated that subcellular fraction lies in peroxysome, being a stable acidic hydrophilic protein. The similarity of tea trees’ CAT amino acid sequence to cotton, western balsam poplar and flax are 93%, 92% and 91% respectively.【期刊名称】《龙岩学院学报》【年(卷),期】2016(034)002【总页数】5页(P111-115)【关键词】铁观音茶树;CsCAT;过氧化氢酶;基因克隆【作者】王仲;赖钟雄;郭玉琼【作者单位】福建农林大学福建福州 350002;福建农林大学福建福州 350002;福建农林大学福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S571.1过氧化氢酶（CAT）是一种广泛存在于植物体内的末端氧化酶，具有催化过氧化氢降解为分子氧和水的功能，对维持植物细胞内的氧化还原平衡具有重要作用［1］。

桂花OfLCYB和OfLCYE启动子的克隆和活性分析沈子又;张超;董彬;付建新;胡绍庆;赵宏波【摘要】Lycopene cyclization is an important branching point in the synthesis of carotenoids. There are two kinds of lycopene cyclase LCYB and LCYE in plants. Previous studies have found that the differential expressions of OfLCYB1,OfLCYE1 and other genes determine the contents of downstream products of carotenoid metabolism in different varieties of Osmanthus fragrans. In this study,1028 bp and 904 bp of the OfLCYB and OfLCYE promoters were cloned by genome walking with the genomic DNA of cultivar'Yanhong Gui'as the template. The bioinformatics analysis discovered two promoter sequences that contained TATA-box and CAAT-box,also the TCA-element of salicylic acid, and some photoresponsive elements such as Sp1,ACE,Box4,and G-box. The OfLCYB promoter also includes abscisic acid response element ABRE,gibberellin response element P-box. OfLCYE promoter includes gibberellin response element GARE-motif and thermal response element HSE. The cloned promoter fragment was recombined with pBI121 vector,and the plant expression vector was constructed and transferred into Agrobacterium tumefaciens. The tobacco leaf was used for transient expression. The results proved that OfLCYB and OfLCYE promoter fragments all had the function of driving downstream reporter gene expression.%番茄红素环化是类胡萝卜素合成过程中的重要分支点,植物中存在两种番茄红素环化酶LCYB和LCYE.前期研究发现,OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差异表达决定了桂花不同品种中类胡萝卜素代谢分支下游产物的含量不同.以'堰虹桂'基因组DNA为模板,通过染色体步移的方法(Genome walking)克隆出OfLCYB和OfLCYE启动子分别为1028 bp和904 bp.通过生物信息学分析发现两个启动子序列包含TATA-box、CAAT-box等基本元件,同时都含有水杨酸响应元件TCA-element,以及一些光响应元件如Sp1、ACE、Box4、G-box等;OfLCYB启动子还包括脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件P-box,OfLCYE启动子包括赤霉素响应元件GARE-motif及热击响应元件HSE.将克隆到的启动子片段与pBI121载体进行重组,构建植物表达载体并转入农杆菌,采用叶盘法侵染烟草叶片进行瞬时表达.结果表明,OfLCYB和OfLCYE启动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)001【总页数】7页(P137-143)【关键词】桂花;启动子;LCYB;LCYE;瞬时表达【作者】沈子又;张超;董彬;付建新;胡绍庆;赵宏波【作者单位】浙江农林大学风景园林与建筑学院,临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,临安 311300;浙江理工大学建筑工程学院,杭州310018;浙江农林大学风景园林与建筑学院,临安 311300【正文语种】中文类胡萝卜素是由异戊二烯骨架构成的C40或C30萜类化合物，是一类重要的天然色素的总称，在可见光下呈红色、橙色或黄色［1］，是果实和花的重要呈色物质之一。

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定杨燕萍;郭素霞;陈晶;林矫矫;刘宗平;程国锋【摘要】目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达.方法利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析.利用实时荧光定量PCR(Real time PCR) 分析该基因在日本血吸虫中的转录情况.原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体.免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析.结果本研究获得了一个编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa.生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性. Real-time PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高.Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白.结论获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2010(026)009【总页数】5页(P830-834)【关键词】日本血吸虫;Argonaute蛋白;RACE;功能分析【作者】杨燕萍;郭素霞;陈晶;林矫矫;刘宗平;程国锋【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海200241;扬州大学兽医学院,扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海200241;扬州大学兽医学院,扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海200241【正文语种】中文【中图分类】R383.2在最近十几年中,研究表明非编码小RNA,诸如小干扰 RNA(small interference RNA,siRNA),微小 RNA(microRNA,miRNA)和 PIWI相关RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)等在生物体的生长发育中发挥重要的调控作用〔1〕,Argonaute通过与小分子RNA选择性结合在此调控进程中扮演重要角色。

《拟南芥EDR2定位、Ca结合特性和在Ca依赖性生长中的生理功能研究》篇一摘要：本文通过对拟南芥中EDR2蛋白的定位、Ca结合特性以及在Ca依赖性生长中的生理功能进行研究，旨在揭示EDR2在植物生长发育过程中的重要作用。

通过生物信息学分析、基因克隆、蛋白纯化、荧光标记定位和生理实验等方法，我们获得了EDR2的相关特性及其在Ca信号传导途径中的功能。

一、引言拟南芥作为一种模式植物，在植物生物学研究中具有重要意义。

EDR2（Enhanced Disease Resistance 2）作为拟南芥中的一个基因编码的蛋白，其在植物响应外界刺激，特别是钙信号传导途径中发挥着重要作用。

本研究旨在探究EDR2的定位、Ca结合特性及其在Ca依赖性生长中的生理功能。

二、材料与方法1. 材料实验所用材料为拟南芥野生型植株及相应转基因株系。

2. 方法（1）生物信息学分析：利用生物信息学软件对EDR2进行序列分析，预测其可能的功能域及定位。

（2）基因克隆及表达：通过PCR技术克隆EDR2基因，并构建相应表达载体。

（3）蛋白纯化及荧光标记：利用蛋白质纯化技术纯化EDR2蛋白，并进行荧光标记以用于后续的定位研究。

（4）细胞定位观察：利用激光共聚焦显微镜观察EDR2在细胞中的定位情况。

（5）Ca结合特性研究：通过钙离子沉淀法研究EDR2与钙离子的结合能力。

（6）生理功能研究：通过转基因技术构建相关株系，并对其在Ca依赖性生长中的表现进行观察和分析。

三、结果与分析1. EDR2的定位研究通过荧光标记技术，我们发现在拟南芥细胞中，EDR2主要定位于细胞质和细胞核中。

这表明EDR2可能在细胞质和细胞核中发挥重要作用。

2. EDR2的Ca结合特性通过钙离子沉淀法，我们发现EDR2具有与钙离子结合的能力。

这表明EDR2可能参与钙信号传导途径。

3. EDR2在Ca依赖性生长中的生理功能通过转基因技术构建的株系在Ca依赖性生长中表现出明显差异。

文冠果是我国北方特有的木本油料树种,其种仁含油量高达50%~70%,富含油酸、亚油酸、神经酸等优质不饱和脂肪酸[1],是国家“十三五”期间大力发展的新型健康木本食用油,在许多工业领域如制药与生物质能源等方面也具有重要的用途。

因此,挖掘调控文冠果种子发育的重要转录因子基因,对提高文冠果种子产量和含油量具有重要意义。

AP2/ERF 转录因子是植物最大的转录因子家族之一,含有1~2个保守的AP2/ERF 结构域[2-3]。

其中AP2亚家族转录因子主要参与植物花、果实和种子等器官生长发育的调控[4]。

APETALA2是AP2亚家族的成员之一,已相继在拟南芥、水稻和葡萄等物种中分离出来[5],而在文冠果中AP2转录因子方面的研究还较少。

因此,本研究在测序获得的转录组数据中筛查文冠果APETALA2(AP2)基因的全长cDNA 序列,通过生物信息学方法分析AP2转录因子的结构特征及功能,为解析文冠果种子生长发育的分子调控机制提供依据,有助于文冠果油品质改良和文冠果分子育种工作。

1材料与方法1.1搜索转录组获得新基因序列从本研究室测序获得的文冠果根、茎、叶的de novo 转录组数据中搜索获得文冠果AP2基因的cDNA 序列。

1.2文冠果AP2基因cDNA 序列的生物信息学分析利用ORFfinder 在线软件(https :///gorf/gorf.html )预测XsAP2基因cDNA 序列的ORF 。

采用Prot-Param 在线软件(http :///protparam/)预测XsAP2蛋白序列的一级结构。

通过ProtScale 在线软件(http :///protscale/)分析XsAP2蛋白的疏水性/亲水性。

利用SOPMA 在线软件(https ://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl )预测XsAP2蛋白序列的二级结构。

采用SWISS-MODEL 软件(http :///)预测XsAP2蛋白的三级结构。