重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立
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重组人血管内皮抑制素的注意事项页数:1
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重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价
重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价作者：刘武姚雪静李壮林来源：《中国实用医药》2011年第30期【摘要】目的研究重组人血管内皮抑制素(endostar)冻干粉针剂的制备和质量控制。
方法以4 %甘露醇、2 %蔗糖、30 mm乙酸钠为辅料，将endostar制备成冻干粉针剂。
分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和高效液相法(HPLC)分析冻干粉的纯度，使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)分析冻干粉的活性，其他检测项目按照《中国药典》进行。
结果 Endostar冻干粉的纯度大于99%，生物学活性每支含量，等电点主区带在8.8~9.8之间，冻干粉用胰蛋白酶消化后，肽图与理化对照品一致。
结论按照此工艺制备的endostar冻干粉针剂各项指标均符合《中国药典》要求。
【关键词】血管内皮抑制素；冻干粉；纯度；生物学活性；肽图Production and Quality Research of Recombinant Human Endostatin Freeze-dried PowderLIU Wu, YAO Xue-jing, LI Zhuang-lin. Shandong Simcere-Medgenn Bio-Pharmaceutical Co., Ltd, Yantai 264006, China【Abstract】 ObjectiveTo prepare recombinant human endostatin (endostar) freeze-dried powder and research its quality.Methods Endostar freeze-dried powder was prepared with 4 % mannitol, 2 % sucrose, 30 mM sodium acetate. The product purity was analysed by SDS-PAGE and HPLC, and biological activity was measured with HUVEC. Other test methods were performed according to chinese pharmacopoeia.Results The purity of endostar freeze-dried powder was more than 99%. Thepeptide mapping of endostar freeze-dried powder was consistent with reference substance.Conclusion Endostar freeze-dried powder prepared in accordance with the process were in line with chinese【Key words】Endostatin; Freeze-dried powder; Purity;Biological activity;Peptide mapping作者单位:264006烟台,山东先声麦得津生物制药有限公司血管内皮抑制素是1997年等从小鼠血管内皮瘤的细胞培养液中分离获得的天然蛋白分子，它是内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成的专一性抑制剂[1]，后来经证实是胶原X VIII NC1结构域C末端的多肽片段[2]。
重组人血管内皮抑制素 Endostatin(制剂与规格、适应证、合理用药要点)
重组人血管内皮抑制素 Endostatin
制剂与规格：针剂：15mg（3ml）/瓶
适应证：本品联合长春瑞滨/顺铂（NP）化疗方案用于
治疗初治或复治的Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。
合理用药要点：
1.重组人血管内皮抑制素与NP方案联合至4个周期，
然后采用本品进行维持治疗。
本品适用于初治或复治的
Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。
2.如果出现以下状况，需暂停使用重组人血管内皮抑
制素：（1）出现相关心脏毒性反应时，如≥3级或≤2级
且毒性反应持续存在。
（2）≥3级皮肤过敏反应。
3.重组人血管内皮抑制素主要相关不良事件发生率：
基于Ⅳ期研究结果，发生率分别为：心律失常（0.7%）、
心功能下降（0.2%）、出血（0.4%）、过敏反应（0.2%）。
4.过敏体质或对蛋白类生物制品有过敏史者慎用。
5.有严重心脏病或病史者慎用，本品临床使用过程中
应定期检测心电图。
CNAL C 2002.01A4-2005 蛋白质—重组人血管内皮抑制素的质量指
C NAL M E T HS 认可检测方法编号：CNAL C 2002.01A4-2005蛋白质—重组人血管内皮抑制素的质量指纹谱分析—基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法Protein—Peptide mass fingerprinting of cytochrome C—Matrix assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry公布日期：2005-08-01中国实验室国家认可委员会公布C NAL M E THS 前言检测/校准标准和方法对于检测/校准活动的有效性具有至关重要的意义。
标准作为得到公认且由标准化管理部门正式发布的技术依据，具有技术可靠性和科学性的特点。
但随着科技进步的速度不断加快，领域不断拓展，以及新事物的不断涌现，标准检测方法总是滞后于需求，因此在应用领域中产生了大量的非标准检测方法。
然而这些方法的有效性将直接影响到检测结果的可靠性。
在作为对实验室能力的通用要求的国际标准ISO/IEC17025中，为规范实验室的检测和校准能力，提出了对非标准方法必须经过确认的要求。
然而，由于方法确认的技术性和复杂性，要求评审专家在现场确认方法的有效性是不切实际的，因此，为保证认可质量，中国实验室国家认可委员会（CNAL）依托我国科技基础条件平台项目“国家分析测试体系”的建设成果，以能力验证活动作为技术平台，按照“科学严谨、重点先行、广泛协作、循序渐进”的原则，对部分实验室提供的非标准检测和校准方法的确认过程和使用情况进行了审查，凡通过审查的方法，CNAL 将其作为公认的方法给予承认。
经CNAL 承认的方法，实验室申请认可时可以直接列入申请认可范围，并且不需要再提供方法确认资料。
经CNAL 审查通过且纳入CNAL 检测方法目录的非标准方法，可来源于国内外权威组织和机构发布的检测/校准推荐方法、研究单位和企业研究成果等。
血管内皮生长因子抑制剂结合活性试验两种结果分析方法比较
中国药事2019年7月第33卷第7期813血管内皮生长因子抑制剂结合活性试验两种结果分析方法比较毕华，李永红，范文红，陶磊，裴德宁，丁有学*,饶春明*(中国食品药品检定研究院，北京100050)摘要目的：对血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)结合活性试验两种结果分析方法进行比较，以考察两者的差异。
方法：采用固定剂量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后，检测未结合的VEGF的量，分别以未结合的VEGF量对V EGF Trap浓度梯度和未结合的V EGF检测板的OD值对VEGF Trap浓度梯度进行四参数方程拟合，两种方法计算该产品的结合活性。
结果：两种方法均满足试验有效性条件，且血管内皮生长因子抑制剂供试品和标准品的半数抑制浓度(IC5。
)均分别为3.68和3.6 pmoL-L-',供试品的结合活性为102%0结论：证明了两种分析方法得到的结果完全一致。
为同类产品结合活性计算方法的选择提供借鉴。
关键词：血管内皮生长因子抑制剂；结合活性；半数抑制浓度；四参数方程中图分类号：R917；R95文献标识码：A文章编号：1002-7777(2019)07-0813-06doi:10.16153/j.1002-7777.2019.07.015Comparison of Two Methods for Analyzing the Results of Vascular Endothelial Growth Factor Inhibitors Binding Activity AssaysBi Hua,Li Yonghong,Fan Wenhong,Tao Lei,Pei Dening,Ding Youxue*,Rao Chunming*(National Institutes for Food and Drug Control,Beijing100050,China)Abstract Objective:To compare the two methods for analyzing the results of vascular endothelial growth factor inhibitors binding activity assays.Methods:After a fixed amount of VEGF was applied to serially dilute VEGF Trap,the amount of unbound VEGF was detected.The two methods were used to calculate the binding activity of the products.One was the four-parameter equation fitting of the concentration gradient of VEGF Trap with the unbound VEGF amount,and the other was the four-parameter equation fitting of the concentration gradient of VEGF Trap with the OD value of the unbound VEGF detection plate.Results:Both methods met the test validity conditions,and the half inhibitory concentration(IC50)of the vascular endothelial growth factor inhibitors*tested samples and the standard substance was3.68and3.6pmoL•L1respectively.The binding activity of the tested samples was102%.Conclusion:The results obtained by the two methods are identical, which provide references for selecting methods for calculating the binding activity of similar products. Keywords:vascular endothelial growth factor inhibitors;binding activity;half inhibitory concentration;four-parameter equation作者简介：毕华，副研究员；研究方向：生物技术药物质量控制；Tel:(010)67095684；E-mail：bihua9418@通信作者：饶春明，研究员；E-mail:raocm@丁有学；E-mail:dingyouxue@814中国药事2019年7月第33卷第7期血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）是具有VEGF阻断作用的重组蛋白，由两种不同的人VEGF受体VEGFR1和VEGFR2的细胞外区域融合到人免疫球蛋白IgG尚Fc部分组成。
人源化抗表皮生长因子受体抗体质控方法和质量标准研究
人源化抗表皮生长因子受体抗体质控方法和质量标准研究*陶磊饶春明王兰韩春梅李响高凯王军志**(中国食品药品检定研究院，北京100050)摘要：目的建立人源化抗表皮生长因子受体抗体的质控方法。
方法应用体外细胞生长抑制实验测定该抗体的生物学活性；电喷雾(ESI)质谱法与还原SDS-PAGE 法测定其准确分子量；去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列；SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度；RP-HPLC测定其肽图；定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量；其他各项指标检测按《中国药典》三部(2010版)要求进行。
结果人源化抗表皮生长因子受体抗体原液的平均相对活性为100%，RSD为20%，成品的平均相对活性为94%，RSD为14%。
电喷雾质谱法测得抗体轻、重链的分子量分别为23372.02Da与50344.21Da，相对误差分别为0.005%与0.006%；轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致；还原SDS-PAGE 结果显示，单抗原液的IgG重链和轻链百分比为98.4%；SEC-HPLC结果显示，单抗原液及成品的纯度分别为98.4%、98.2%。
肽图测定结果与理化对照品一致；定量PCR测得其外源DNA残留量小于100pg/剂量；其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求。
结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体抗体的质控方法，可用于该制品的常规质量控制。
关键词：表皮生长因子受体人源化抗体质量控制Study on Methods and Requirements for Quality Control ofHumanized IgG1 Antibody against Epithelial Growth FactorReceptorTAO Lei, RAO Chun-ming, WANG Lan, HAN Chun-mei, LI Xiang, GAO Kai,WANG Jun-zhi(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish methods and requirements for qualitycontrol of humanized IgG1 antibody against epithelial growth factor receptor (EGFR).*国家863计划项目（2007AA021601）与重大新药创制（2009ZX09307）资助项目**通讯作者 E-mail: wangjz@METHODS Biological potency of the antibody was determined by cell growth inhibition assay in vitro. Its molecular mass was measured by ESI mass spectrometry and reduced SDS-PAGE. By Edman degradation after deblocking the N-terminal amino acid sequences were tested. The purity was analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPLC. Peptide mapping was assayed by RP-HPLC. Using real-time PCR and DNA hybridization method, CHO residual DNA was detected. Routine tests were all carried out according to Pharmacopoeia of People’s Republic of China (volume Ⅲ, 2010 edition). RESULTS The relative biological potency of the bulk was 100% with RSD of 20%, and finished product was 94% with RSD of 14%. The molecular masses of light and heavy chains measured by ESI spectrometry were 23372.02Da and 50344.21Da, with relative error of 0.005% and 0.006% respectively. N-terminal sequences of light and heavy chains were consistent with the theory. The results of purity were 98.4% (bulk) detected by reduced SDS-PAGE, 98.4% (bulk) and 98.2% (finished product) by SEC-HPLC. The peptide mapping showed comparability with reference standard. By real-time PCR, its CHO residual DNA was lower than 100pg/dose. Other results of tests complied with Pharmacopoeia of People’s Republic of China (volume Ⅲ, 2010 edition). CONCLUSION The methods and requirements for quality control of humanized IgG1 antibody against EGFR were established gradually, which can be used for its routine quality control.KEY WORDS: epithelial growth factor receptor; humanized antibody; quality control表皮生长因子受体（EGFR）是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，其信号通路在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的作用[1]。
重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价
重组人血管内皮抑制素冻干粉针剂的研制和质量评价【摘要】目的研究重组人血管内皮抑制素(endostar)冻干粉针剂的制备和质量控制。
方法以4 %甘露醇、2 %蔗糖、30 mm乙酸钠为辅料，将endostar制备成冻干粉针剂。
分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和高效液相法(HPLC)分析冻干粉的纯度，使用人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)分析冻干粉的活性，其他检测项目按照《中国药典》进行。
结果Endostar冻干粉的纯度大于99%，生物学活性每支含量2.4×105U，等电点主区带在8.8~9.8之间，冻干粉用胰蛋白酶消化后，肽图与理化对照品一致。
结论按照此工艺制备的endostar冻干粉针剂各项指标均符合《中国药典》要求。
【Abstract】ObjectiveTo prepare recombinant human endostatin (endostar) freeze-dried powder and research its quality.Methods Endostar freeze-dried powder was prepared with 4 % mannitol, 2 % sucrose, 30 mM sodium acetate. The product purity was analysed by SDS-PAGE and HPLC, and biological activity was measured with HUVEC. Other test methods were performed according to chinese pharmacopoeia.Results The purity of endostar freeze-dried powder was more than 99%. The biological activity was 2.4±105U per piece and isoelectric point was between 8.8~9.8.The peptide mapping of endostar freeze-dried powder was consistent with reference substance.Conclusion Endostar freeze-dried powder prepared in accordance with the process were in line with chinese pharmacopoeia standards.【Key words】Endostatin; Freeze-dried powder; Purity;Biological activity;Peptide mapping血管内皮抑制素是1997年O Reilly等从小鼠血管内皮瘤的细胞培养液中分离获得的天然蛋白分子，它是内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成的专一性抑制剂[1]，后来经证实是胶原X VIII NC1结构域C末端的多肽片段[2]。
重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定
ｐ ｄａｙ１ Ａ ｅｓ 质粒 的介导与腺病毒包装质 粒 ｐ ｄ ｒ ｋＣ — Ｅ Ｆ ６ 转染至 人胚 肾细胞 Ｈ Ｋ ９ ， 同源重 Ａ Ｔａ ＭＶ Ｖ Ｇ １５共 ｃ Ｅ ２３ 经 组后获得携带人 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ的重组腺 病毒 ｐ ｄ ｒｃ ＭＶ Ｖ Ｇ １５ Ａ ＴａｋＣ — Ｅ Ｆ ６ 。应用 Ｐ Ｒ鉴定重组腺病毒 ， Ｃ 空斑传代纯化病
医 盘查（ 电王 ） ！ 生 旦箍 鲞筮 期 Ｃｉ Ｊ ｌｉａｓＥｅｒ ｉＥｉｏ）Ｊ ｕｒ １， １．ｏ ６ Ｎ． ｈ Ｃｉｃｎ（ｌ ｔｎ ｄｉ ，ｎａ ２ ２Ｖ １ ．ｏ２ ｎ ｎｉ ｃｏ ｃ ｔｎ ａ ｙ ５ ０ ．
・
论 著 ・
重 组 人 血 管 内皮 生 长 因子 １５腺 病 毒 载 体 的 ６ 构 建 与鉴 定
ａ ｅ ｏ ｉａ ｅ ｔｒ ＨＥ Ｃ ｕ — ｉＬ Ｕ —ａ ｇ，ｌＧ ａ ｇ ｌ Ｗ ｄ ｎ ｖｒ ｖ ｃｏ ｌ ｈ ｎ ｌ ， Ｉ Ｗｕｙ ｎ Ｊ ｕ ｎ —ｉ ＡＮＧ Ｍａ —ｕ ｎ， Ｉ ｎ ｄ ， ｅ ｎ， ｏｙ ａ Ｘ ＡＯ Ｗｅ —ｅ
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（ Ｖ Ｇ ，ｏ ｆｒ ｅ ｅｅ ｔ ｎｆ ｏｐｏｉｅａ ｘｅｉｅ ｔ ａｉ ｏ ｃｎｔ ｃｎ ｉ ｕ ｎｉｅｒ ｇ ｂｎ ｆ ｈ Ｅ Ｆ） ｆ ｕｔ ｒｇｎ ｒ ｓ ｒｔ ｒｖｄ ｎ ｅｐｒ ｎａ ｂｓ ｆ ｏ ｓ ｕｔ ｇｔｓｅｅ ｇ ｅ ｎ ｏｅ ｏ ｒ ｈ ａ ｅ ｍ ｌ ｓ ｒ ｉ ｓ ｎ ｉ
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ Ｔ ｏｓｕｔ ｄｎｖｕ ｅ ｏ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｔ ｕ ａ ｖｓ ｌ ｎｏ ｅａ ｇ ｗｈｆ ｔ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅ ｉ ｏｃｎｔｃ ａｅｏｉ ｓｖ ｔ ｆ ｈ ｈｍ ｎ ａｃ ａ ｅｄｔ ｌｌ ｒ ｔ ａ ｏ ｃｖ ｒ ｒ ｃｒ ｅ ｕｒ ｈ ｉ ｏ ｃ ｒ
血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立
基预稀释 rhVEGF121 至 1. 25 nmol ／ L，再以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养基进行 2. 5 倍稀释，共 6 个 稀释度，每一稀释度设 2 个复孔；将稀释好的 rhVEGF121 加入已接种 293 细胞的培养板内，10 μl ／ 孔，混合， 置 37℃，5% CO2 条件下培养 5 ～ 7 h，室温条件下平 衡至少 10 min；加入荧光素酶底物溶液，100 μl ／ 孔， 混合后在室温条件下反应 30 ～ 70 min，用 Spectra Max Gemini XS 酶标仪在细胞培养板上读取相对光 单位（Relative light units，RLU）数值。 1. 5 VEGF Trap 的生物学活性检测
采用荧光素酶报告基因检测系统，取对数生长 期的 293 细胞，经胰蛋白酶消化后，以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 1. 25 × 105 个 ／ ml，接种于白色底部不透明的 96 孔 细胞培养板中，每孔 80 μl，37℃，5% CO2 条件下培 养 15 ～ 20 h；以含 0. 1% FBS 的 Opti-MEMⅠ培养
【关键词】 血管内皮生长因子抑制剂；生物学活性；荧光素酶检测系统
Development of A Method for Determination of Biological Activity of Vascular Endothelial Growth Factor Trap
WANG Lan, RAO Chun-ming, LI Yong-hong, et al（National Institute for the Control of Pharmaceutical and Bio－ logical Products, Beijing 100050, China）
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在进行新生物制品产品开发时，首先要做的一项工作是建立理化对照品及活性标准品。
理化对照品主要用于产品肽图、等电点、相对分子质量、纯度等理化性质的检测；活性参考品主要用于产品生物学活性的检测［1］。
进行理化对照品质量标准及质量方法的研究既便于检测和跟踪产品质量的一致性和稳定性，也是产品进一步走向临床和市场的必然要求，《中国药典》三部（2015版）也对其提出了明确规定［2-3］。
重组人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂是有VEGF阻断作用的重组蛋白，由2种不同的人VEGF受体VEGFR1和VEGFR2的细胞外区域，融合到人免疫球蛋白IgG1的Fc部分组成，是一种二聚体糖蛋白，其蛋白质相对重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立毕华，陶磊，韩春梅，秦玺，范文红，杨靖清，丁有学，饶春明中国食品药品检定研究院重组药物室，北京100050摘要：目的建立重组人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂理化对照品质控方法及质量标准。
方法利用HEK293细胞增殖抑制法测定重组人VEGF抑制剂理化对照品生物学活性；紫外分光光度法测定蛋白含量；质谱法进行相对分子质量测定、液质肽图及糖基化位点分析、二硫键分析、N-寡糖糖型及比例分析；SDS-PAGE及SEC-HPLC法分析纯度；等点聚焦法进行电荷异质性分析；Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。
结果重组人VEGF抑制剂理化对照品各项检定指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部（2015版）相关要求。
结论建立的质控方法和质量标准符合理化对照品的相关规定，具有保证该理化对照品结构正确、质量可控的特点。
检定合格的理化对照品可用于该类产品的常规检定。
关键词：血管内皮生长因子抑制剂；理化对照品；质量控制中图分类号：R979.1+9R392-33文献标识码：A文章编号：1004-5503（2017）08-0833-05Establishment of methods and standard for quality control ofphysicochemical reference substance for recombinanthuman vascular endothelial growth factor inhibitorBI Hua,TAO Lei,HAN Chun-mei,QIN Xi,FAN Wen-hong,YANG Jing-qing,DING You-xue,RAO Chun-mingNational Institutes for Food and Drug Control,Beijing100050,ChinaCorresponding author:RAO Chun-ming,E-mail:raocm@；DING You-xue,E-mail:dingyouxue@Abstract：Objective To establish the methods and standard for quality control of the physicochemical reference sub-stance for recombinant human vascular endothelial growth factor inhibitor（rhVEGF inhibitor）.Methods The biological activity of reference substance for rhVEGF inhibitor was determined by HEK293cell proliferation inhibition test,while the protein content by ultraviolet（UV）spectrophotometry.The relative molecular mass,liquid peptide map,glycosylation site, disulfide bond,type and proportion of N-oligosaccharide of the reference substance were analyzed by mass spectrometry, while the purity by SDS-PAGE and SEC-HPLC,the charge heterogeneity by isoelectric focusing,and the N-terminal amino acid sequence by Edman degradation method.Results All the indexes of rhVEGF inhibitor met the requirements in Guideline for Quality Control of Recombinant DNA Products for Human Use and Chinese Pharmacopoeia（Volume III, 2015edition）.Conclusion The established methods and standard met the requirements for the relevant physical and chemical reference substances,which may assure that the structure of the reference substance is correct and the quality is controllable.The qualified reference substance may be used for the routine quality control of products of the same kind.Key words：Vascular endothelial growth factor（VEGF）inhibitor;Physicochemical reference substance;Quality control·治疗性制剂·通讯作者：饶春明，E-mail：raocm@；丁有学，E-mail：dingyouxue@DOI:10.13200/ki.cjb.001845分子质量为96900。
其中含有约15%的糖基化，总相对分子质量为115000，结构较复杂。
在成年啮齿类和灵长类动物中，VEGF抑制剂可预防脉络膜新血管形成，减少视网膜血管渗漏和炎症［4-5］，具有广阔的应用前景。
本文以申报临床阶段的重组人VEGF抑制剂理化对照品为例，根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部（2015版）的要求，结合该产品的特点，进行了质量标准建立的相关研究［6-8］，现将结果报道如下。
1材料与方法1.1对照品及参考品重组人VEGF抑制剂理化对照品、活性参考品、rhVEGF121由申报单位提供。
1.2细胞HEK293细胞由申报单位提供。
1.3主要试剂及仪器荧光素酶受体基因检测系统购自美国Promega公司；糖苷酶PNGaseF和Rapid PNGase F酶购自美国NEB公司；DMEM培养基、FBS、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、遗传霉素（geneticin，G418）、OptiMEM培养基均购自美国Gibco公司；潮霉素B（hygromycin B）购自德国Roche公司；GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒（176003606）、蛋白酶解表面活性剂Rapi Gest SF、ACQUITY H Class超高效液相色谱系统、Xevo G2QTOF质谱仪及Unify操作软件购自美国Waters 公司；乙腈购自美国Fisher Scientific公司；Trypsin 购自美国Sigma公司；SpectraMax M5多功能酶标仪及SOFTMAX分析软件购自美国Molecular Device 公司；PPSQ21A蛋白质测序仪购自日本岛津公司。
1.4生物学活性测定用含10%FBS、1%双抗溶液、1%NEAA、0.5%G418和0.1%潮霉素B的DMEM培养基培养HEK293细胞。
取对数生长期细胞，胰酶消化后，用OptiMEM+0.1%FBS培养基中和，560×g 离心5min，弃上清，用OptiMEM+0.1%FBS培养基重悬，调整细胞浓度为1.25×105个／ml，接种至96孔板中，80μl／孔，置培养箱培养15～20h。
用OptiMEM+0.1%FBS培养基将理化对照品和活性参考品预稀释至5nmol／L，再于96孔板上进行倍比稀释，共8个浓度梯度，每个梯度设2个复孔。
将以上稀释好的对照品和活性参考品加入已接种HEK293细胞的培养板内，10μl／孔，再加入用Opti MEM+0.1%FBS培养基配制的浓度为200pmol／L 的rhVEGF121溶液10μl，得到rhVEGF121最终浓度为20pmol／L。
混合后置37℃，5%CO2条件下培养5～7h。
用荧光素酶受体基因检测系统进行检测，利用SOFT MAX软件分析数据，以VEGF抑制剂的浓度为横坐标，对应的平均RLU（相对光单位）值为纵坐标，选用的回归模型为四参数方程，绘制每个板的活性参考品和供试品剂量反应曲线。
根据各供试品的IC50，按下式计算其生物学活性。
供试品相对百分效价（%）=供试品IC50／活性参考品IC50×100%1.5蛋白含量测定用10mmol／L磷酸钠缓冲液，150mmol／L NaCl的缓冲液稀释供试品至0.25～1.0mg／ml，并使用缓冲液制备1份空白溶液，其稀释因子应与样品溶液的稀释因子一致。
在紫外分光光度计中测量其A280和A320值。
校正样品吸光度：A280，校正=A280-A320，确保A280校正值在0.282～1.207AU范围内。
样品浓度（mg／ml）=（A280，校正×DF）／EC式中DF为稀释因子，EC为消光系数（1.15ml／mg）。
1.6质谱相对分子质量测定参考文献［9-11］进行。
1.6.1样品的还原及切糖取1支样品，用变性溶液稀释至1mg／ml，取0.5ml，加入1mol／ml的DTT 溶液10μl，45℃孵育30min；用10k的超滤管将缓冲液置换为反应溶液，终体积0.5ml，取100μl，加入5μl糖苷酶PNGaseF，37℃孵育3h；瞬时离心，取上清。