甲基绿-派洛宁染色液

实验八核酸细胞化学——甲基绿一派洛宁法(methyl green—pyronin method)【目的要求】(1) 学会制作血涂片。

(2) 熟悉甲基绿一派洛宁法显示核酸的原理及操作步骤。

(3) 观察DNA、RNA在细胞中的分布。

【实验原理】甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，与带负电荷的磷酸根形成盐键。

甲基绿分子有两个正电荷，易与双链DNA分子结合，使DNA显示绿色，派洛宁分子有一个正电荷，易与单链RNA结合使RNA显示红色。

也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关(图5—5)。

【实验用品】(1) 器材：注射器、载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜。

(2) 试剂：①0.2mol／L醋酸缓冲液(pH4.8)：A．冰醋酸1.2ml加蒸馏水至100ml。

B．醋酸钠(NaAc·3H20)2.72g溶于100ml。

使用时，A液与B液按2：3比例混合。

②甲基绿一派洛宁染色：A．2 g甲基绿加0.2mol／L醋酸缓冲液至100ml；B．1.0g派洛宁Y加醋酸缓冲液至100ml；临用时：甲液与乙液5：2混合即成。

甲基绿中常混有甲基紫，如不除去，会影响染色效果。

纯化甲基绿的方法是：先把甲基绿倒入分液漏斗，加入氯仿，用力摇匀，静置，弃去溶有甲基紫的氯仿，再换入新氯仿。

如此，反复几次，直到氯仿无甲基紫的颜色为止，干燥之后备用。

此法为显示DNA、RNA的经典方法，配制染色试剂时要注意比例适当。

(3) 材料：蟾蜍血涂片。

【方法与步骤】(1) 蟾蜍血涂片，干燥后入70％乙醇溶液固定10min，取出晾干。

(2) 滴染色液于血膜上，染15min。

(3) 蒸馏水冲洗。

(4) 95％乙醇溶液分色，晾干，封片。

【观察结果】蟾蜍红细胞的核因含DNA显绿色，细胞质及核仁因含RNA显示红色。

【作业】绘蟾蜍红细胞图示DNA、RNA的分布。

实验室规那么和要求一般规定1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“平安〞是进展任何实验最重要的事项。

2.在实验室内请穿著实验衣〔最好长及膝盖下〕，防止穿著凉鞋、拖鞋〔脚趾不要裸露〕。

留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。

3.在实验室内制止吸烟、吃东西、饮食、化装、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外套及杂物等。

4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。

每组分配之仪器、耗材请在课程开场前确定清点与保管，课程完毕后如数清点缴回。

公用仪器请善加爱惜使用。

实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境清洁。

5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的考前须知。

实验进展中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。

打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。

实验后，适切记下自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。

6.身体不适、睡眠缺乏、精神不济或注意力无法集中，请立即停顿实验。

实验时间假设延长，请注意时间的管制及自身的平安，不可自行逗留实验室。

7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验室前记得洗手。

8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变措施。

药品1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、考前须知，翻阅物质平安资料，查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。

2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、考前须知及配制日期，为防止污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。

3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂〔如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、-巯基乙醇、甲醛、酚等〕要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，假设不小心打翻试剂，马上处理。

4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺〔神经毒〕、溴化乙啶〔突变剂〕、SDS〔粉尘〕请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好习惯。

一、埃利希(EhrIiCh)氏苏木精染液先将苏木精2g溶于IOOm1乙醇中，再加冰醋酸IOm1,混合后加蒸储水IOOm1和IOOm1甘油，然后加硫酸铝钾(约Iog)至饱和，搅拌均匀，倒入瓶中。

将瓶口用1层纱布包着小块棉花塞上，放在暗处通风的地方，并经常摇动促进“成熟”，直到液体颜色变为深红色为止。

成熟时间约2-4周。

若加0.4g碘酸钠可加快成熟。

二、吉姆萨(GiemSa)氏母液将吉姆萨粉末Ig先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66m1)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。

然后再加入甲醇(66m1),搅匀后保存于棕色瓶中。

母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。

临用时用PH6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。

三、瑞(Wright)氏染液称取瑞氏染料粉末OJg于研钵内研细后，加入少量甲醇再反复研磨，最后将全部甲醇(总共60m1)加入研匀，染料全部溶解后，将染液保存于棕色瓶内备用。

四、醋酸洋红染液将洋红粉末Ig倒入IOOm145%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸(沸腾时间不超过30s),冷却后过滤，即可使用。

也可再加入1%~2%铁明矶水溶液5-10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止。

如制作永久标本染色时，可加入饱和氢氧化铁或醋酸铁(媒染剂)溶液数滴，至染色液呈浅蓝色为止。

五、硫堇染液(工作液)①干液(硫堇)：硫堇Ig或2g溶于Ioom150%乙醇中，溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：醋酸钠∙3H2O9.7g,巴比妥钠14.7g,溶于50Om1蒸储水中；③0.1mo1/1盐酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，调pH5.7±0.2,即得硫堇工作液。

六、0.02%盾纳斯绿B(JanusGreenB)用0.9%生理盐水溶液配制。

七、甲基绿一派洛宁染液(Unna试剂)派洛宁0.25g,甲基绿0.15g,95%乙醇20m1,甘油20m1。

甲基绿-派洛宁染色液染色方法及注意事项货号：G1670规格：100mL/500mL保存：室温避光储存，有效期至少12个月。

产品说明：甲基绿-派洛宁染色液(Methyl Green-Pyronin Staining Solution，也称MGP染色液)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成绿色或蓝绿色，把细胞浆和细胞核中的核仁染成红色的染色液。

甲基绿可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色；而派洛宁可以和细胞浆或核仁中的RNA结合，从而可以使细胞浆和核仁被染色。

可以和免疫荧光染色或免疫组化染色配合使用。

一方面可以在本甲基绿-派洛宁染色液染色后进行免疫荧光染色或其它染料的染色，另一方面也可以在免疫组化染色后再进行甲基绿-派洛宁复染。

一个包装的本染色液至少可以染色200个样品。

染色方法:（仅供参考）1.样品处理a.对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡5-10分钟。

换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。

无水乙醇5分钟。

90%乙醇2分钟。

70%乙醇2分钟。

蒸馏水2分钟。

b.对于冰冻切片：蒸馏水2分钟。

c.对于培养细胞：用4%多聚甲醛固定10分钟以上。

蒸馏水洗涤2分钟。

换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2分钟。

2.甲基绿-派洛宁染色对于上述处理好的样品：甲基绿-派洛宁染色液染色5分钟左右(可以根据染色结果和要求调整时间)。

蒸馏水洗涤2-3次(每次数秒钟)。

3.脱水、透明、封片或进行其它染色丙酮脱水3次，每次1-2秒。

换用丙酮/二甲苯(1:1)洗涤2次，每次1-2分钟。

二甲苯透明1-2分钟。

换用新鲜的二甲苯，再透明1-2分钟。

用中性树胶或其它封片剂封片。

显微镜下观察，细胞核呈绿色或蓝绿色，而细胞浆和核仁呈红色。

注意事项：1.需自备4%多聚甲醛、70%乙醇和95%乙醇。

如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。

如果样品是石蜡切片，需自备90％乙醇，无水乙醇以及二甲苯。

2.样品数量较多时，可以使用索来宝的染色架和染色缸，便于操作。

甲基绿派洛宁染色原理甲基绿是一种常用的生物染色剂，它在细胞学和组织学研究中有着广泛的应用。

而甲基绿派洛宁染色法则是一种常用的细胞染色方法，它可以用于观察细胞核的形态和结构，有助于研究细胞的生物学特性。

在本文中，我们将介绍甲基绿派洛宁染色的原理及其在细胞学研究中的应用。

甲基绿派洛宁染色法是一种常用的细胞染色方法，它主要用于观察细胞核的形态和结构。

该方法的原理是利用甲基绿染料与派洛宁溶液结合后，能够在细胞核内形成一种特殊的染色效果。

这种染色效果能够使细胞核显现出深蓝色或紫色，从而便于观察和研究细胞核的形态和结构特征。

甲基绿派洛宁染色法的操作步骤相对简单，首先将待染细胞进行固定处理，然后用甲基绿染料染色，再用派洛宁溶液进行后续处理，最后用显微镜观察染色效果。

通过这种方法，可以清晰地观察到细胞核的形态、大小和结构，有助于研究细胞的生物学特性，如细胞分裂、细胞凋亡等过程。

甲基绿派洛宁染色法在细胞学研究中有着广泛的应用。

首先，它可以用于观察细胞核的形态和结构，有助于研究细胞的生物学特性。

其次，该方法还可以用于细胞计数和细胞分类，对于细胞学研究具有重要意义。

此外，甲基绿派洛宁染色法还可以用于临床病理诊断，帮助医生观察和诊断细胞核异常的病变情况。

总之，甲基绿派洛宁染色法是一种常用的细胞染色方法，它能够清晰地显示细胞核的形态和结构，有着广泛的应用价值。

在细胞学研究和临床病理诊断中，甲基绿派洛宁染色法都发挥着重要作用，对于推动细胞学和病理学领域的发展具有重要意义。

希望本文能够对甲基绿派洛宁染色法的原理及应用有所帮助，为相关领域的研究工作提供参考。

山东大学细胞生物学实验报告蟾蜍红细胞甲基绿—派洛宁染色姜政2012/10/9实验目的：学习用甲基绿—派洛宁染色观察验证蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布，掌握血涂片制作，了解甲基绿—派洛宁染色的基本原理和应用以及细胞化学的基本概念。

实验原理：核酸（脱氧核糖核酸，DNA；核糖核酸，RNA）的结构单体核苷酸由核糖、碱基和磷酸基团构成。

由于嘌呤碱基和嘧啶碱基环上都有含孤对电子的N，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤都含有-NH2，因此，在水溶液中，核苷酸碱基（图1）上这些含有孤对电子的N既可以接受质子（-NH2+H+→-NH3+，N：+H+→N+:H），也可以释放质子（-NH3+→-NH2+H+，N+:H- H+→N：+H+）。

通常，核苷酸中的磷酸基团存在两步解离，且碱基N上H+的解离常数在磷酸基团一级解离（-PO3H2→-PO3-H+H+）常数和二级解离（-PO3-H→-PO32-+H+）常数之间，所以，当磷酸基团一级解离与碱基N上H+的解离恰好使核苷酸静电荷为零时，核苷酸就达到了等电点。

因此，在水溶液中，核酸分子可以被看作是两性电解质，由于DNA与RNA的组成不同，两者等电点不同，在同一份溶液中的电性就略有不同。

图1. 五种核苷酸碱基的结构和孤对电子示意图（左，引自Stacey D. Wetmore等，2000）和甲基绿、派洛宁的分子结构（右）。

甲基绿（Methyl Green）和派洛宁（Pyronin）都是具有芳香体系且能够发生电离的染料分子（图1），在水中发生电离后都成为带正电的分子。

因此，甲基绿和派洛宁都是碱性染料，专染酸性核酸分子。

电离后的甲基绿分子带两个正电荷，派洛宁分子带一个正电荷。

这种电荷上的差异使两种染料分子具有不同的染色性质。

加之两种染料分子具有完全不同的颜色（甲基绿是亮绿色，派洛宁是红色），两种染料配合使用的染色剂（Unna试剂）很早就成为区分细胞中DNA与RNA分布的常用试剂[1]。

甲基绿-派洛宁对核酸着色的机理可以分解为两步，第一步是电荷相互作用下染料分子向特定核酸分子的靠近，第二步是疏水相互作用下染料分子与核酸分子的结合[2,3]。

DNA的细胞化学——Feulgen反应核酸是细胞中的重要组分，主要包括DNA和RNA。

DNA是遗传信息的载体，主要存在于细胞核中；RNA传递DNA的遗传信息，指导细胞合成各种蛋白质。

核酸的细胞化学研究已有近一个世纪的历史，1924年Feulgen和Rossenbeck于1924年创立显示DNA的特异性反应，1940年Brachet发明了甲基绿一派洛宁染色方法用以区别细胞中的DNA和RNA。

这些经典方法目前仍被广泛应用，并得到不断改进和发展。

研究细胞中核酸的含量及其动态变化，对于理解生长、发育、分化及凋亡等生物学基本问题具有重要的价值。

孚尔根反应(Feulgen reaction)是特异性显示DNA的最经典方法，得到了非常广泛的应用。

其原理是DNA经过稀盐酸水解后的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，脱氧核糖的C 端形成游离的醛基。

游离的醛基再同Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。

甲基绿和派洛宁是2种碱性染色料，二者分别属于三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物，与酸性的核酸具有亲和力，可以形成盐键而呈现出特殊的颜色反应。

在pH4.6时甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。

甲基绿分子具有2个正电荷，与聚合程度高的DNA具有较强的亲和力，与DNA双螺旋外侧的磷酸根基团结合从而阻止派洛宁从碱基之间插入，甲基绿与DNA的结合产物呈绿色；派洛宁只有1个正电荷，与低聚分子RNA具有较强的亲和力，中和RNA的磷酸基团，阻止甲基绿染色，派洛宁与RNA的结合物呈红色。

根据颜色的部位可以判断DNA和RNA的定位并且判断两种核酸的相对含量。

这一反应对pH敏感，脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。

【实验目的】学习DNA的Feulgen染色方法，并了解Feulgen反应原理及其DNA在细胞中的分布。

掌握甲基绿-派洛宁法（methyl green-pyronin method）并了解DNA和RNA在细胞中的分布。

一、实验目的1. 学习毛囊组织的采集和制备方法。

2. 掌握毛囊组织在显微镜下的观察技巧。

3. 了解毛囊组织的基本结构和功能。

二、实验原理毛囊组织是皮肤的重要组成部分，负责头发的生长和更新。

本实验通过采集毛囊组织，制备成切片，在显微镜下观察其结构和功能。

三、实验材料1. 新鲜动物皮肤2. 刀片3. 无菌生理盐水4. 玻片5. 70%乙醇6. 热水浴锅7. 显微镜8. 光学切片机9. 甲基绿-派洛宁染色液四、实验步骤1. 采集毛囊组织取新鲜动物皮肤，用刀片沿毛囊方向切取，避免损伤毛囊组织。

将采集到的毛囊组织放入70%乙醇中消毒。

2. 制备毛囊组织切片将消毒后的毛囊组织放入无菌生理盐水中，用刀片将其切成薄片，厚度约为5-10微米。

将切片放入70%乙醇中固定。

3. 染色将固定好的切片放入甲基绿-派洛宁染色液中，染色时间为30分钟。

染色后，用蒸馏水冲洗切片，去除多余染料。

4. 观察显微镜将染色后的切片放在玻片上，用显微镜观察毛囊组织。

调整显微镜焦距，观察毛囊的基本结构和功能。

5. 记录实验结果观察毛囊组织的细胞结构、毛囊生长阶段、毛囊附属器官等，并记录实验结果。

五、实验结果与分析1. 毛囊组织细胞结构毛囊组织主要由毛囊、毛囊鞘、毛囊乳突和毛囊皮脂腺组成。

毛囊位于毛囊鞘内部，由毛囊母细胞、毛囊外根鞘细胞、毛囊内根鞘细胞和毛囊上皮细胞组成。

2. 毛囊生长阶段毛囊生长阶段分为生长期、退化期和休止期。

在显微镜下，可以观察到毛囊生长阶段的变化。

3. 毛囊附属器官毛囊附属器官包括毛囊皮脂腺、毛囊汗腺和毛囊神经。

在显微镜下，可以观察到毛囊附属器官的结构和功能。

六、实验结论通过本实验，我们成功制备了毛囊组织切片，并在显微镜下观察到了毛囊的基本结构和功能。

实验结果表明，毛囊组织在皮肤的生长、代谢和调节等方面具有重要作用。

七、实验讨论1. 实验过程中，应尽量减少毛囊组织的损伤，以保证实验结果的准确性。

2. 毛囊组织切片制备过程中，切片厚度要适中，过厚或过薄都会影响观察效果。

•论 著•牛蛙血细胞核酸和脊髓运动神经细胞的显色观察** 基金项目：山西省高等学校科技创新项目(2020L0749)；山西省高等学校大学生创新创业训练计划重点项目(2020777)；山西省吕梁市科技计划项目(2020SHFZ29)；山西医科大学汾阳学院引进人才启动基金项目(2020A01)。

作者简介：徐本锦，男，讲师，主要从事细胞与分子生物学研究。

本文引用格式：徐本锦，刘玲，宣焱，等.牛蛙血细胞核酸和脊髓运动神经细胞的显色观察国际检验医学杂志,2021,42(2):161-164.徐本锦，刘玲，宣焱，杜淼山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西吕梁032200摘要：目的建立牛蛙血细胞核酸及脊髓运动神经细胞显色方法，更好地服务教学和临床。

方法制备临时装片，用福尔根反应和甲基绿-派洛宁对细胞内的核酸进行显色，用甲苯胺蓝染液对脊髓运动神经细胞进行 染色。

结果 福尔根反应后，细胞核呈紫红色，细胞质呈绿色。

该反应的最适条件为室温水解2 min,60 C 水解8 min ，再室温水解2 min ，复染40 s 。

甲基绿-派洛宁染色后，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色。

甲苯胺蓝染 色后，脊髓运动神经细胞被染成深蓝色。

结论 福尔根反应中亮绿复染的最适时间为40 s 。

甲基绿-派洛宁能够对细胞内的DNA 和RNA 同时进行定位、定性分析。

该研究方法对实验教学、科学研究和临床实践具有一定 的理论和实际意义。

关键词：福尔根反应；甲基绿-派洛宁；核酸；牛蛙血细胞；运动神经细胞DOI ：10. 3969/j. issn. 16734130. 2021. 02. 008中图法分类号:Q2-33文章编号：1673-4130(2021 )0201 6105 文献标志码:AColoration observation of blood cell nucleic acids and spinal motor nerve cells in bullfrog *XU Benjin ,LIU Ling ，XU A N Yan , DU MiaoLaboratory Mediciee of Department in Fen y ang College of Shanxi MedicalUniversity Lvliang ，Shanxi 032200 ? ChiaAbstract :Objective To establish the coloration methods of blood cell nucleic acid and spinal motor nervecells in bullfrog in order to better serve the teaching and clinic. Methods The temporary slides of bullfrogblood ce l s were prepared and the coloration of intrace l ular nucleic acid was performed by using the Feulgen reactionand methylgreen-pyronin.Thebu l frogspinalmotornervece l swerestainedbyusingtoluidineblue.Results The nucleus was purple red after Feulgen reaction , and the cytoplasm was green. The optimum conditions forthe reaction were hydrolysis for 2 min at the room temperature ? for 8 min at 60 C , re-hydrolysis for 2 min at the roomtemperature ，andre-dyeing for40 s. Afterstaining with methylgreen-pyronin ，the nucleus appeared blue and the cyto ­plasm was pink. The spinal motor nerve cells were dyed dark blue. Conclusion The optimum time of light, green re ­dyeing in Feulgen reaction was 40 s. Met.hylgreen-pyronin is capable to simultaneously conduct the localization and qualitative analysis of intracellular DNA and RNA. This study method has a certain theoretical and practical signii - canceforexperimentalteaching ，cientificresearchandclinicalpractice.Key words ： Feulgen reaction ；methylgreen-pyronin ； nucleic acids; bullfrog blood cells ； motornervece l s核酸的细胞化学染色是利用化学试剂与核酸分 子反应生成带颜色的产物，从而达到对细胞内DNA 和RNA 定位和定性的目的，是细胞遗传学研究的重要手段。

RNA的细胞化学高熹1120152430(李安一)（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：甲基绿、派洛宁为两种碱性染料。

甲基绿分子有两个正电荷，易与双链DNA结合，使DNA显示绿色，派洛宁分子有一个正电荷，易与RNA结合，使RNA 显示红色。

该实验利用了甲基绿-派洛宁染料，对洋葱鳞茎内表皮进行染色，通过颜色的分布，观察洋葱鳞茎内表皮中的RNA和DNA的分布情况，得出二者的分布规律。

关键词：实验；甲基绿-派洛宁；DNA；RNA；分布1 引言甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。

当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。

甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。

而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。

即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。

洋葱鳞茎的外表皮中色素含量较高，呈现出了紫颜色，如果对其进行染色会对结果造成一定程度上的干扰，而洋葱鳞茎的内表皮中色素较少，颜色基本上是无色的，进行染色可以清晰地看到染色的结果，减少了其他的干扰。

同时，洋葱鳞茎内表皮是单层的，平整地铺在载玻片上，无需做其他处理就可以用光镜进行观察。

DNA分子在90摄氏度的时候会发生解螺旋，成为DNA单链，而三氯乙酸对DNA有沉淀作用，使染色剂无法与其有效结合，无法对DNA有效染色。

2 实验材料2.1 实验仪器显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸。

2.2 实验材料洋葱鳞茎内表皮。

2.3 实验试剂2.3.1 Unna试剂：甲基绿－派洛宁染色液甲液：5％派洛宁水溶液6ml2％甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）16ml甲液与乙液分别置于4冰箱备用，使用时两溶液混匀即可。