实验八 甲基绿一派洛宁法

甲基绿-派洛宁染色液染色方法及注意事项货号：G1670规格：100mL/500mL保存：室温避光储存，有效期至少12个月。

产品说明：甲基绿-派洛宁染色液(Methyl Green-Pyronin Staining Solution，也称MGP染色液)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成绿色或蓝绿色，把细胞浆和细胞核中的核仁染成红色的染色液。

甲基绿可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色；而派洛宁可以和细胞浆或核仁中的RNA结合，从而可以使细胞浆和核仁被染色。

可以和免疫荧光染色或免疫组化染色配合使用。

一方面可以在本甲基绿-派洛宁染色液染色后进行免疫荧光染色或其它染料的染色，另一方面也可以在免疫组化染色后再进行甲基绿-派洛宁复染。

一个包装的本染色液至少可以染色200个样品。

染色方法:（仅供参考）1.样品处理a.对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡5-10分钟。

换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。

无水乙醇5分钟。

90%乙醇2分钟。

70%乙醇2分钟。

蒸馏水2分钟。

b.对于冰冻切片：蒸馏水2分钟。

c.对于培养细胞：用4%多聚甲醛固定10分钟以上。

蒸馏水洗涤2分钟。

换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2分钟。

2.甲基绿-派洛宁染色对于上述处理好的样品：甲基绿-派洛宁染色液染色5分钟左右(可以根据染色结果和要求调整时间)。

蒸馏水洗涤2-3次(每次数秒钟)。

3.脱水、透明、封片或进行其它染色丙酮脱水3次，每次1-2秒。

换用丙酮/二甲苯(1:1)洗涤2次，每次1-2分钟。

二甲苯透明1-2分钟。

换用新鲜的二甲苯，再透明1-2分钟。

用中性树胶或其它封片剂封片。

显微镜下观察，细胞核呈绿色或蓝绿色，而细胞浆和核仁呈红色。

注意事项：1.需自备4%多聚甲醛、70%乙醇和95%乙醇。

如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。

如果样品是石蜡切片，需自备90％乙醇，无水乙醇以及二甲苯。

2.样品数量较多时，可以使用索来宝的染色架和染色缸，便于操作。

(一)甲基绿—派罗宁法鉴定DNA、RNAJ[原理]核酸分子因含有磷酸根呈酸性，它们对碱性染料甲基绿和派罗宁具有亲和力，但这两种碱性染料具有选择性。

RNA易被派罗宁染成红色，而DNA被甲基绿染成绿色，故可用来鉴定核酸。

[器材与试剂]器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧片、培养皿、吸管、镊子、刀片或切片机、分液漏斗等.试剂：(1)甲基绿的精制：市售的甲基绿中含有甲基紫，甲基紫溶于氯仿，可用萃取法除去甲基紫，方法：先配制2％甲基绿水溶液，置于分液漏斗中，然后加氯仿洗涤数次，弃除氯仿，反复多次直至氯仿层中不显紫色，水层备用。

(2)派罗宁的精制：先配制5％水溶液，置于分液漏斗中，用氯仿洗涤数次，待氯仿不显红色为止，弃除氯仿水层备用。

(3)0.2mol/L醋酸缓冲液，pH4.8(0.2mol/L醋酸40ml+0.2mol/L醋酸60ml)。

(4)甲基绿—派罗宁溶液：1ml2％甲基绿水溶液+1.75ml派罗宁水溶液+pH4.80.2mol/L醋酸缓冲液25ml+水25ml，混合液可保存一周。

[方法与步骤]1.撕取马铃薯嫩茎的表皮或洋葱鳞茎表皮(12层细胞)，或制作待鉴材料的切片。

2.把表皮或切片置于载玻片上，加甲基绿—派罗宁溶液(以浸没材料为宜)，染色1520分钟。

3.用蒸馏水洗去多余的染液(如染色太深，可用70％乙醇洗涤)。

4.用滤纸吸干水分，用丙酮脱水及分色,20分钟后镜检。

结果：细胞核(DNA)被染成绿色，其中核仁(RNA)被染成红色。

(二)孚尔根法鉴定[原理]在酸性环境(1NHCl，60℃)中，DNA的脱氧戊糖转变为醛的形式，锡夫试剂与醛基反应，产生紫色化合物，此反应可特异地显示核中的DNA。

[器材与试剂]器材：器材同前。

试剂：(1)锡夫试剂(配法见前)。

(2)10％K2S2O5。

(3)1NHCl：8.3ml浓HCl加水稀释至100ml。

(4)亚硫酸溶液：5ml10％K2S2O5加5ml1NHCl，加水稀释至100ml(也可用2％亚硫酸氢钠溶液代替)。

姓名 xxxx 班级 xxxxxx 同组人 xxxxxxxx 科目细胞生物学实验题目脂类的化学——苏丹Ш染色组别第2组一．实验目的1.熟悉脂类的显示技术。

2.了解脂类在细胞中的分布。

二．实验原理脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。

很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。

脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。

脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。

其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。

脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。

60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。

丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。

用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。

常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。

用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。

本实验中使用的脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。

苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。

苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪。

当它与含有脂类的标本接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂结构中使其显色。

三．实验仪器及试剂1.仪器解剖盘，解剖剪，镊子，盖玻片，载玻片，显微镜，胶头滴管2.试剂苏丹Ш染液，甲醛钙溶液，70%乙醇溶液，蒸馏水3.材料小白鼠一只四．实验步骤1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中。

甲基绿派洛宁染色原理甲基绿是一种常用的核酸染色剂，它能够与DNA发生特异性的结合，因此在生物学实验和临床诊断中得到了广泛的应用。

而派洛宁则是一种经常与甲基绿一起使用的染色剂，它们的结合可以增强染色效果，使得细胞核和染色体更加清晰可见。

本文将介绍甲基绿派洛宁染色原理，以及其在实验和临床中的应用。

甲基绿派洛宁染色的原理主要是基于甲基绿和派洛宁与DNA的特异性结合。

甲基绿是一种碱性染料，它可以与DNA的磷酸基团发生静电作用，从而使得DNA分子呈现出深蓝色。

而派洛宁则可以与甲基绿形成复合物，增强染色效果，使得细胞核和染色体更加清晰可见。

这种染色原理使得甲基绿派洛宁在核酸染色实验中得到了广泛的应用。

在实验室中，甲基绿派洛宁染色常常用于核酸电泳实验。

核酸电泳是一种常用的生物学实验方法，用于分析DNA或RNA的大小和数量。

在核酸电泳实验中，样品中的DNA或RNA经过电泳分离后，需要进行染色以观察其分离情况。

甲基绿派洛宁染色可以使得DNA 或RNA在凝胶中呈现出明显的条带，便于分析和识别。

此外，甲基绿派洛宁染色还常用于细胞核染色和染色体观察，能够帮助研究人员观察细胞结构和染色体形态，从而进行细胞生物学和遗传学研究。

除了在实验室中的应用，甲基绿派洛宁染色在临床诊断中也具有重要意义。

在临床病理学中，医生常常需要观察组织切片中的细胞核和染色体，以帮助诊断疾病。

甲基绿派洛宁染色可以使得细胞核和染色体清晰可见，有助于医生进行病理诊断。

此外，在肿瘤细胞学检查中，甲基绿派洛宁染色也常用于观察肿瘤细胞的形态和结构，为临床诊断提供重要依据。

总的来说，甲基绿派洛宁染色原理是基于甲基绿和派洛宁与DNA的特异性结合，能够使得细胞核和染色体清晰可见。

在实验室和临床中，甲基绿派洛宁染色被广泛应用于核酸电泳实验、细胞核染色、染色体观察以及临床病理诊断等领域，为科研工作者和医生提供了重要的帮助。

通过对甲基绿派洛宁染色原理的深入了解，可以更好地掌握其在实验和临床中的应用，为科研和医学工作提供更多的可能性。

【实验目的】了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。

【实验原理】甲基绿—派洛宁（Methyl green-Pyronin）为碱性染料，它能分别与细胞内的DNA、RNA 结合而呈现不同颜色。

当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。

其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。

甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。

而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。

即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。

【实验仪器、材料和试剂】（一）器材显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸（二）材料洋葱鳞茎表皮（三）试剂1．Unna试剂：甲基绿—派洛宁（Methyl green-Pyronin）染色液甲液：5%派洛宁水溶液6ml2%甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1M醋酸缓冲液（pH=4.8）16ml甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀。

2．1M醋酸缓冲液（pH=4.8）配方A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml 。

B液：醋酸钠13.5g加蒸馏水100ml 。

取A液40ml+ B液60ml 混匀即为pH=4.8 。

配制注意事项：（1）Pyronin可加热助溶。

（2）Methyl green批号不同，染色效果差别很大。

商品Methyl gr e en常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。

【方法与步骤】1．用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。

2．滴一滴Unna试剂，染色30min。

3．蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。

4．盖上盖玻片，镜检。

对照片：（1）撕取洋葱鳞茎内表皮，经5%三氯醋酸中90℃水浴处理15min 。

一．实验目的1.熟悉脂类的显示技术。

2.了解脂类在细胞中的分布。

二．实验原理脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。

很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。

脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。

脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。

其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。

脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。

60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。

丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。

用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。

常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。

用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。

本实验中使用的脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。

苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。

苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪。

当它与含有脂类的标本接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂结构中使其显色。

三．实验仪器及试剂1.仪器解剖盘，解剖剪，镊子，盖玻片，载玻片，显微镜，胶头滴管2.试剂苏丹Ш染液，甲醛钙溶液，70%乙醇溶液，蒸馏水3.材料小白鼠一只四．实验步骤1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中。

剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下放置一载玻片，用剪将连同载玻片和其上粘着的肠系膜取下。

报告成绩实时记录成绩实验二 Feulgen反应显示DNA学生姓名学号班级座位号：同组同学日期： 2014 年 10 月 14 日备注：【Introduction】常用DNA定性和定量分析的方法及原理：（1）Feulgen反应：DNA经酸水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。

（2）甲基绿-派洛宁法：甲基绿-派洛宁为碱性染料，分别与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。

甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

（3）HE染色：即苏木精-伊红染色法。

苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

（4）Giemsa染色：含天青、伊红等，可与DNA上的磷酸基团结合，使染色体呈蓝紫色，而细胞质呈淡蓝色。

（5）免疫荧光技术：将已知的抗原或抗体标记上荧光素，反应后，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的黄绿色或桔红色荧光，从而确定抗原或抗体的定位，测定含量。

（6）显微光度术：利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定。

（7）流式细胞术：在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多快速的定量分析，可以高速分析上万个细胞，并能同时测量细胞的物理或化学性质。

【Materials & methods】实验材料：四膜虫培养液（200μl）；Carnoy固定液；Schiff试剂；1mol/L HCl；自来水；亮绿溶液；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；恒温水浴锅两台（60℃），恒温培养箱一台（30℃）。

实验操作：吸取少量四膜虫培养液于载玻片→干燥→用卡诺固定液固定10到20分钟→在盐酸内水浴15分钟左右→用Schiff试剂染色40分钟（要避光、30度恒温）→自来水清洗2次→亮绿溶液复染1到2秒钟→再次水洗→干燥→放在显微镜下观察。

科目细胞生物学实验题目甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布【实验目的】1.学会制作血涂片；2.熟悉甲基绿——派洛宁法显示核酸的原理与操作步骤；3.观察DNA、RNA在细胞中的分布。

【实验原理】1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。

在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。

甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，在水中电离后，都产生带阳电荷的离子，常与带负电荷的磷酸根形成盐键。

甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强，易与双链DNA分子（胞核等电点pH3.8～4.2）进行极性吸着而结合，使DNA显示绿色；派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，与单链RNA （胞质等电点pH4.6～5.2）吸附结合，使RNA显示红色。

2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。

因此，甲基绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。

【甲基绿——派洛宁法实验步骤】1．取蟾蜍（蟾蜍破髓，仰位剪去下颌、舌头）制备血涂片，干燥后滴加70%的乙醇溶液固定10分钟，晾干。

2．滴染色液于血膜上，染15分钟。

（或在染色缸中）3．蒸馏水冲洗，去染液。

4．向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色、同时倾斜载片弃液体，晾干。

5. 观察。

甲基绿—派洛宁染液配制试剂：0.2mol/l醋酸缓冲液（PH4.8）A液：冰醋酸1.2ml+蒸馏水至100mlB液：醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72克溶于100ml蒸馏水中使用时，A液与B液按2：3比例混合。

甲基绿—派洛宁染液A液:2克甲基绿加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。

B液:1克派洛宁Y加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。

临用时，A液于B液5：2混合。

甲基绿派洛宁法试剂配制（改良Cook，1974）（一）2%甲基绿水溶液：甲基绿（methyl green）1g蒸馏水加至50ml用三氯甲烷抽提，方法详后。

甲基绿派洛宁染色原理甲基绿是一种常用的生物染色剂，它可以与细胞内的DNA结合并发出荧光信号，因此在生物学研究中有着广泛的应用。

而洛宁则是一种常用的染色试剂，它可以与甲基绿结合形成稳定的复合物，从而增强甲基绿的荧光信号。

本文将重点介绍甲基绿派洛宁染色的原理及其在生物实验中的应用。

甲基绿是一种阳离子染料，它可以通过静电作用与DNA中的负电荷部分结合。

DNA分子中的磷酸基团带有负电荷，而甲基绿分子带有正电荷，因此它们之间会发生静电吸引。

当甲基绿与DNA结合时，会发出绿色荧光，这种荧光信号可以被荧光显微镜或荧光分析仪检测到，从而用于观察和分析DNA分子的位置和数量。

然而，甲基绿的荧光信号并不十分强烈，因此在一些实验中需要增强其荧光信号。

这时就需要借助洛宁这种染色试剂。

洛宁是一种螯合剂，它可以与甲基绿形成稳定的复合物，从而增强甲基绿的荧光信号。

洛宁分子中含有多个芳香环结构，这些结构可以与甲基绿分子中的芳香环结构发生π-π堆积作用，从而使甲基绿分子在洛宁的作用下形成更稳定的结构，进而增强其荧光信号。

甲基绿派洛宁染色原理的应用非常广泛。

在生物学实验中，研究人员常常利用甲基绿派洛宁染色来观察和分析细胞内的DNA分布和数量。

例如，在细胞凋亡实验中，通过甲基绿派洛宁染色可以观察到细胞核的形态变化和DNA的断裂，从而判断细胞是否发生了凋亡。

此外，在细胞培养实验中，甲基绿派洛宁染色也可以用于观察细胞的增殖和分裂情况，从而研究细胞生长和分化的机制。

总之，甲基绿派洛宁染色原理是一种重要的生物染色方法，它可以用于观察和分析DNA在细胞内的位置和数量，从而在生物学研究中发挥着重要作用。

通过了解甲基绿派洛宁染色的原理及其应用，我们可以更好地利用这一技术手段进行生物实验，并取得更加准确和可靠的实验结果。

甲基绿-派洛宁染色液简介：甲基绿-派洛宁染色液(Methyl Green-Pyronin Stain ，MGP)甲基绿-派洛宁染色液是一种把细胞核染成绿色或蓝绿色，把细胞浆和细胞核中的核仁染成红色或红紫色的染色液。

甲基绿又称双绿SF ，属于碱性染料，是具有金属光泽的绿色微结晶或粉末，分子量为608.78，分子式为C 27H 35Cl 4N 3Zn 。

甲基绿和细胞核中的DNA 结合，从而使细胞核染成绿色或蓝绿色，派洛宁可以和细胞浆或核仁中的RNA 结合，从而使细胞浆和核仁染成红色或红紫色。

Leagene 甲基绿-派洛宁染色液经过改良，不含甲醇，在组织或细胞染色中对细胞核进行染色，其中的甲基绿经过提纯，更容易着色。

本染色液也可以和免疫荧光染色或免疫组化染色配合使用。

10ml 染色液可以染色20个样本。

组成：自备材料：1、系列乙醇、蒸馏水2、滤纸、RNase(可选)3、丁三醇或丙酮或正戊醇4、4%多聚甲醛操作步骤(仅供参考)：(一)石蜡切片染色1、组织入Carnoy 固定液或10%中性福尔马林，固定。

2、切片5μm ，常规脱蜡至水，蒸馏水稍洗。

3、入Methyl Green-Pyronin Stain ，室温浸染。

4、取出切片，用滤纸稍微吸干切片周围染色液。

5、用丁三醇(也可用丙酮或正戊醇)冲洗。

6、二甲苯透明，中性树胶封固。

(二)冰冻切片染色1、蒸馏水冲洗。

编号 名称 DN0001 DN0001 Storage Methyl Green-Pyronin Stain 50ml 100ml RT 避光 使用说明书 1份2、切片入Methyl Green-Pyronin Stain，室温浸染25～50min。

3、用蒸馏水冲洗2次，此时样本呈蓝色。

4、余下步骤同石蜡切片染色。

(三)细胞染色1、用多聚甲醛固定以上。

2、蒸馏水洗涤。

3、换用新鲜的蒸馏水，再洗涤。

4、用Methyl Green-Pyronin Stain染色。