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山东大学细胞生物学实验报告蟾蜍红细胞甲基绿—派洛宁染色姜政2012/10/9实验目的：学习用甲基绿—派洛宁染色观察验证蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布，掌握血涂片制作，了解甲基绿—派洛宁染色的基本原理和应用以及细胞化学的基本概念。
实验原理：核酸（脱氧核糖核酸，DNA；核糖核酸，RNA）的结构单体核苷酸由核糖、碱基和磷酸基团构成。
由于嘌呤碱基和嘧啶碱基环上都有含孤对电子的N，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤都含有-NH2，因此，在水溶液中，核苷酸碱基（图1）上这些含有孤对电子的N既可以接受质子（-NH2+H+→-NH3+，N：+H+→N+:H），也可以释放质子（-NH3+→-NH2+H+，N+:H- H+→N：+H+）。
通常，核苷酸中的磷酸基团存在两步解离，且碱基N上H+的解离常数在磷酸基团一级解离（-PO3H2→-PO3-H+H+）常数和二级解离（-PO3-H→-PO32-+H+）常数之间，所以，当磷酸基团一级解离与碱基N上H+的解离恰好使核苷酸静电荷为零时，核苷酸就达到了等电点。
因此，在水溶液中，核酸分子可以被看作是两性电解质，由于DNA与RNA的组成不同，两者等电点不同，在同一份溶液中的电性就略有不同。
图1. 五种核苷酸碱基的结构和孤对电子示意图（左，引自Stacey D. Wetmore等，2000）和甲基绿、派洛宁的分子结构（右）。
甲基绿（Methyl Green）和派洛宁（Pyronin）都是具有芳香体系且能够发生电离的染料分子（图1），在水中发生电离后都成为带正电的分子。
因此，甲基绿和派洛宁都是碱性染料，专染酸性核酸分子。
电离后的甲基绿分子带两个正电荷，派洛宁分子带一个正电荷。
这种电荷上的差异使两种染料分子具有不同的染色性质。
加之两种染料分子具有完全不同的颜色（甲基绿是亮绿色，派洛宁是红色），两种染料配合使用的染色剂（Unna试剂）很早就成为区分细胞中DNA与RNA分布的常用试剂[1]。
甲基绿-派洛宁对核酸着色的机理可以分解为两步，第一步是电荷相互作用下染料分子向特定核酸分子的靠近，第二步是疏水相互作用下染料分子与核酸分子的结合[2,3]。
甲基绿-派洛宁染色方法在慢性子宫内膜炎诊断中的应用目的:探讨甲基绿-派洛宁染色方法在慢性子宫内膜炎诊断中的应用。
方法:采用Cook甲基绿-派洛宁提纯法染色子宫内膜组织,诊断慢性子宫内膜炎。
结果:294例子宫内膜组织有64例诊断为慢性子宫内膜炎。
结论:甲基绿-派洛宁染色方法是一种简便、经济、实用的方法,可以做为慢性子宫内膜炎诊断的首选方法。
标签：甲基绿-派洛宁;慢性子宫内膜炎;诊断慢性子宫内膜炎为子宫内膜的慢性炎症。
慢性子宫内膜炎虽然发病率较低,可一旦患病则会给患者生活、工作带来诸多影响,也给患者本人造成许多痛苦。
在子宫内膜间质内找到浆细胞是诊断子宫内膜炎的关键。
但是,混杂在子宫内膜间质细胞之间的浆细胞很不容易找到,不成熟的浆细胞就更不容易辨认。
造成慢性子宫内膜炎漏诊。
我们应用甲基绿-派洛宁染色方法帮助辨认浆细胞,确诊慢性子宫内膜炎64例,现报告如下。
1材料及方法1.1材料山西省汾阳医院门诊及住院功能性子宫出血病例294例。
1.2方法采用Cook甲基绿-派洛宁提纯法[1][试剂配制](1)甲基绿原液2%甲基绿溶液,氯仿抽提五次。
(2)派洛宁原液2%派洛宁。
(3)醋酸缓冲液(pH4.8)0.2M醋酸液41ml,0.2M醋酸钠59ml。
(4)甲基绿-派洛宁染液。
甲基绿提纯液15ml,派洛宁原液1ml,醋酸缓冲液20ml,甘油10ml。
临用前配制。
[染色步骤](1)组织切片脱蜡至水。
(2)用醋酸缓冲液(pH4.8)浸洗。
(3)置于甲基绿-派洛宁染液染色3分钟。
(4)用醋酸缓冲液(pH4.8)清洗。
(5)滤纸吸干,迅速丙酮分化30秒。
(6)用纯丙酮、二甲苯等量(1:1)混合液分化、脱水30秒。
(7)二甲苯透明,光学树胶封固。
2结果图1294例功能性子宫出血病人的子宫内膜组织,其中64例诊断为慢性子宫内膜炎。
子宫内膜组织呈淡红色,浆细胞核呈绿色,浆细胞胞浆呈鲜红色。
在HE形态下,子宫内膜间质内有散在的或成簇淋巴细胞浸润,部分淋巴细胞出现浆细胞样分化,较少出现典型的成熟的浆细胞。
RNA的细胞化学高熹1120152430(李安一)（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：甲基绿、派洛宁为两种碱性染料。
甲基绿分子有两个正电荷，易与双链DNA结合，使DNA显示绿色，派洛宁分子有一个正电荷，易与RNA结合，使RNA 显示红色。
该实验利用了甲基绿-派洛宁染料，对洋葱鳞茎内表皮进行染色，通过颜色的分布，观察洋葱鳞茎内表皮中的RNA和DNA的分布情况，得出二者的分布规律。
关键词：实验；甲基绿-派洛宁；DNA；RNA；分布1 引言甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。
当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。
其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。
甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。
而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。
即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。
洋葱鳞茎的外表皮中色素含量较高，呈现出了紫颜色，如果对其进行染色会对结果造成一定程度上的干扰，而洋葱鳞茎的内表皮中色素较少，颜色基本上是无色的，进行染色可以清晰地看到染色的结果，减少了其他的干扰。
同时，洋葱鳞茎内表皮是单层的，平整地铺在载玻片上，无需做其他处理就可以用光镜进行观察。
DNA分子在90摄氏度的时候会发生解螺旋，成为DNA单链，而三氯乙酸对DNA有沉淀作用，使染色剂无法与其有效结合，无法对DNA有效染色。
2 实验材料2.1 实验仪器显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸。
2.2 实验材料洋葱鳞茎内表皮。
2.3 实验试剂2.3.1 Unna试剂：甲基绿－派洛宁染色液甲液：5％派洛宁水溶液6ml2％甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）16ml甲液与乙液分别置于4冰箱备用，使用时两溶液混匀即可。
甲基绿-派洛宁染色液说明书货号：G1670规格：100mL/500mL保存：室温避光储存，有效期至少12个月。
产品说明：甲基绿-派洛宁染色液(Methyl Green-Pyronin Staining Solution，也称MGP染色液)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成绿色或蓝绿色，把细胞浆和细胞核中的核仁染成红色的染色液。
甲基绿可以和细胞核中的DNA结合，从而产生细胞核染色；而派洛宁可以和细胞浆或核仁中的RNA结合，从而可以使细胞浆和核仁被染色。
可以和免疫荧光染色或免疫组化染色配合使用。
一方面可以在本甲基绿-派洛宁染色液染色后进行免疫荧光染色或其它染料的染色，另一方面也可以在免疫组化染色后再进行甲基绿-派洛宁复染。
一个包装的本染色液至少可以染色200个样品。
染色方法:（仅供参考）1.样品处理a.对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟。
蒸馏水2分钟。
b.对于冰冻切片：蒸馏水2分钟。
c.对于培养细胞：用4%多聚甲醛固定10分钟以上。
蒸馏水洗涤2分钟。
换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2分钟。
2.甲基绿-派洛宁染色对于上述处理好的样品：甲基绿-派洛宁染色液染色5分钟左右(可以根据染色结果和要求调整时间)。
蒸馏水洗涤2-3次(每次数秒钟)。
3.脱水、透明、封片或进行其它染色丙酮脱水3次，每次1-2秒。
换用丙酮/二甲苯(1:1)洗涤2次，每次1-2分钟。
二甲苯透明1-2分钟。
换用新鲜的二甲苯，再透明1-2分钟。
用中性树胶或其它封片剂封片。
显微镜下观察，细胞核呈绿色或蓝绿色，而细胞浆和核仁呈红色。
注意事项：1.需自备4%多聚甲醛、70%乙醇和95%乙醇。
如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。
如果样品是石蜡切片，需自备90％乙醇，无水乙醇以及二甲苯。
2.样品数量较多时，可以使用索来宝的染色架和染色缸，便于操作。
细胞的凋亡的形态学检测一、甲基绿-派诺宁染色法检测细胞凋亡实验目的：1、了解细胞凋亡在光镜下的细胞学现象。
2、通过实验观察，了解细胞凋亡与死亡的本质不同。
3、通过本实验，熟练掌握甲基绿-派诺宁染色法检测细胞凋亡。
实验原理：细胞凋亡是指机体在一定的生理、病理条件下，为维持内环境稳定，通过基因控制而使细胞主动有序地死亡，且表现一系列形态和生化方面的特征。
是细胞正常的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，不造成炎症和自体的损伤，是细胞为了更好地适应自下而上环境而主动争取的死亡过程。
因这一死亡过程严格受到程序的控制，又称为细胞程序性死亡。
与凋亡不同，细胞坏死是指细胞在各种致损伤因素的作用下无序死亡的过程，形态特征为细胞胀大，特别是细胞器肿大，胞膜破裂，胞浆内容物外泄，而核变化较慢，DNA降解不充分，局部严重的炎症反应等。
植物细胞凋亡检测方法的实质就是区分正常的细胞、正在进行凋亡的活细胞和坏死或凋亡结束后死亡的细胞。
通常主要采用的手段有：形态学观察法、生化及分子生物学法、免疫学方法、生理学检测法等。
甲基绿-派诺宁染色法：细胞凋亡和坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。
细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。
而坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA损失。
根据这一特点，可利用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，甲基绿对染色质中的DNA选择性结合显示绿色或者蓝色；派诺宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。
如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色(呈现红紫色)者为凋亡细胞，呈现阴性染色者（蓝绿色）为坏死细胞。
实验仪器、材料和试剂：（1）仪器、用具：光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、50ml小烧杯、冰箱（2）材料：洋葱根尖、洋葱鳞茎内表皮、大蒜根尖、鸡血细胞、小鼠肝细胞( 3) 试剂：Unna试剂：甲基绿派诺宁染液甲液：5%Pyronin水溶液（可加热助溶）6ml2%甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1M醋酸盐缓冲液（pH=4.8）16ml；甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时混匀。
科目细胞生物学实验题目甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布甲基绿——派洛宁法显示细胞内DNA、RNA的分布【实验目的】1.学会制作血涂片；2.熟悉甲基绿——派洛宁法显示核酸的原理与操作步骤；3.观察DNA、RNA在细胞中的分布。
【实验原理】1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。
在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。
甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，在水中电离后，都产生带阳电荷的离子，常与带负电荷的磷酸根形成盐键。
甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强，易与双链DNA分子（胞核等电点pH3.8～4.2）进行极性吸着而结合，使DNA显示绿色；派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，与单链RNA （胞质等电点pH4.6～5.2）吸附结合，使RNA显示红色。
2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。
因此，甲基绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。
【甲基绿——派洛宁法实验步骤】1．取蟾蜍（蟾蜍破髓，仰位剪去下颌、舌头）制备血涂片，干燥后滴加70%的乙醇溶液固定10分钟，晾干。
2．滴染色液于血膜上，染15分钟。
（或在染色缸中）3．蒸馏水冲洗，去染液。
4．向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色、同时倾斜载片弃液体，晾干。
5. 观察。
甲基绿—派洛宁染液配制试剂：0.2mol/l醋酸缓冲液（PH4.8）A液：冰醋酸1.2ml+蒸馏水至100mlB液：醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72克溶于100ml蒸馏水中使用时，A液与B液按2：3比例混合。
甲基绿—派洛宁染液A液:2克甲基绿加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。
B液:1克派洛宁Y加0.2mol/l醋酸缓冲液至100ml。
临用时，A液于B液5：2混合。
甲基绿派洛宁法试剂配制（改良Cook，1974）（一）2%甲基绿水溶液：甲基绿（methyl green）1g蒸馏水加至50ml用三氯甲烷抽提，方法详后。
甲基绿-派洛宁染色液简介：甲基绿-派洛宁染色液(Methyl Green-Pyronin Stain ，MGP)甲基绿-派洛宁染色液是一种把细胞核染成绿色或蓝绿色，把细胞浆和细胞核中的核仁染成红色或红紫色的染色液。
甲基绿又称双绿SF ，属于碱性染料，是具有金属光泽的绿色微结晶或粉末，分子量为608.78，分子式为C 27H 35Cl 4N 3Zn 。
甲基绿和细胞核中的DNA 结合，从而使细胞核染成绿色或蓝绿色，派洛宁可以和细胞浆或核仁中的RNA 结合，从而使细胞浆和核仁染成红色或红紫色。
Leagene 甲基绿-派洛宁染色液经过改良，不含甲醇，在组织或细胞染色中对细胞核进行染色，其中的甲基绿经过提纯，更容易着色。
本染色液也可以和免疫荧光染色或免疫组化染色配合使用。
10ml 染色液可以染色20个样本。
组成：自备材料：1、系列乙醇、蒸馏水2、滤纸、RNase(可选)3、丁三醇或丙酮或正戊醇4、4%多聚甲醛操作步骤(仅供参考)：(一)石蜡切片染色1、组织入Carnoy 固定液或10%中性福尔马林，固定。
2、切片5μm ，常规脱蜡至水，蒸馏水稍洗。
3、入Methyl Green-Pyronin Stain ，室温浸染。
4、取出切片，用滤纸稍微吸干切片周围染色液。
5、用丁三醇(也可用丙酮或正戊醇)冲洗。
6、二甲苯透明，中性树胶封固。
(二)冰冻切片染色1、蒸馏水冲洗。
编号 名称 DN0001 DN0001 Storage Methyl Green-Pyronin Stain 50ml 100ml RT 避光 使用说明书 1份2、切片入Methyl Green-Pyronin Stain，室温浸染25～50min。
3、用蒸馏水冲洗2次，此时样本呈蓝色。
4、余下步骤同石蜡切片染色。
(三)细胞染色1、用多聚甲醛固定以上。
2、蒸馏水洗涤。
3、换用新鲜的蒸馏水，再洗涤。
4、用Methyl Green-Pyronin Stain染色。
甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色法在显示乳腺组织凋亡细胞中的应用发表时间：2012-04-16T16:05:19.920Z 来源：《中外健康文摘》2012年第7期供稿作者：邹阳强[导读] 甲基绿是一种生物染色剂，是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末，溶于水。
邹阳强（贵州航天医院病理科贵州遵义 563000）【中图分类号】R655.8【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）7-0193-02【关键词】组合染色乳腺组织凋亡细胞凋亡细胞的检测有苏木精—伊红染色、特殊染色、原位末端标记法、免疫组织化学、琼脂糖凝胶电流、ELISA检测法、电镜、FCM检测法等方法，众多研究方法各具特点，也有其局限性[1]。
形态学检测是凋亡细胞一种较常用、较直观的检测方法，为了提高凋亡细胞的染色效果，本实验利用甲基绿—派洛宁—马休黄组合染色显示乳腺组织中凋亡细胞获得满意结果，为乳腺组织凋亡细胞的研究提供一种较好的形态学研究方法。
现介绍如下。
1 材料和方法1.1 材料收集贵州航天医院病理科2011年01月至2011年10月临床手术切除送检的乳腺标本30例，其中乳腺增生症10例，乳腺纤维腺瘤10例，乳腺癌10例。
4%中性甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。
1.2 试剂配制 2%甲基绿水溶液：甲基绿1g，蒸馏水50ml，充分溶解后取2%甲基绿水溶液20ml，置分液漏斗中，再加入20ml三氯甲烷摇荡3min，静置10min可见甲基绿和三氯甲烷分成两层，打开活塞放掉比重高的三氯甲烷，经多次反复洗除后至三氯甲烷无色即可得改造后的甲基绿，置冰箱内保存[2]。
派洛宁染色液：派洛宁2.5g，蒸馏水100ml，充分溶解。
马休黄染色液：马休黄0.5g，95%乙醇100ml，磷钨酸0.2g，充分溶解待饱和后使用。
应用染色液：改造后的甲基绿10ml，派洛宁染色液5ml，丙三醇15ml，0.2M醋酸缓冲液（pH4.8）20ml。
1.3 染色程序①石蜡切片4μm，常规脱蜡至水洗。
甲基绿派洛宁染色原理甲基绿派洛宁是一种常用的生物染色剂，广泛应用于细胞和组织的染色工作中。
它的染色原理主要是利用其与细胞或组织中的特定成分发生化学反应，从而使其呈现出特定的颜色。
下面我们将详细介绍甲基绿派洛宁的染色原理。
首先，甲基绿派洛宁是一种亲脂性染料，它可以与细胞膜中的脂质结合，从而在细胞膜上形成一层薄膜。
这一薄膜可以增强细胞的对比度，使细胞的结构更加清晰可见。
其次，甲基绿派洛宁还可以与细胞内的核酸发生作用。
在碱性条件下，甲基绿派洛宁会与DNA和RNA中的磷酸基团结合，形成稳定的染色复合物。
这种复合物呈现出绿色或蓝色，使细胞核在显微镜下呈现出明显的颜色。
此外，甲基绿派洛宁还可以与细胞质中的蛋白质结合。
在酸性条件下，甲基绿派洛宁会与蛋白质中的氨基酸发生反应，形成稳定的染色复合物。
这种复合物可以使细胞质呈现出特定的颜色，有助于观察细胞质内各种结构的分布和形态。
总之，甲基绿派洛宁的染色原理是多方面的，它可以与细胞膜、核酸和蛋白质发生化学反应，从而实现对细胞和组织的染色。
通过合理的染色条件和观察方法，可以清晰地观察到细胞和组织的各种结构和形态特征，为细胞学和组织学研究提供了重要的技术支持。
在实际的染色工作中，我们需要根据样品的特点和研究的目的，选择合适的染色方法和条件，以达到最佳的染色效果。
同时，我们也需要在染色过程中注意控制好染色时间和染色剂的浓度，避免出现染色不均匀或染色过度的情况。
总的来说，甲基绿派洛宁作为一种重要的生物染色剂，在细胞学和组织学研究中发挥着重要作用。
了解其染色原理，掌握好染色技术，将有助于我们更准确地观察和分析细胞和组织的结构特征，推动科学研究的进展。
设计性实验方案课程名称细胞生物学题目名称 DNA的原位显示专业生物科学学号学生姓名指导教师时间邯郸学院生命科学与工程学院说明一、实验设计的目的实验设计是培养学生综合运用所学知识与技能，初步训练学生获得分析和解决实际问题的能力的实践性教学环节之一。
通过实验设计培养学生运用所学知识设计课题的能力，为毕业论文的开展，以及今后从事生产、教学、科研等相关工作打下坚实基础。
二、实验设计的要求1、以小组为单位，提出与专业、课程有关的课程设计题目。
命题要求既有代表性，又有实际意义。
2、设计应包括以下几个部分构成：（1）研究的目的与意义。
应说明此项研究在生产实践上或对某些技术进行改革带来的经济、生态与社会效益。
有的课题过去曾进行过，但缺乏研究，现在可以在理论上做些探讨，说明其对科学发展的意义。
（2）国内外同类研究的概况综述。
在广泛查阅有关文献后，对该类课题研究已取得的成就与尚存在的问题进行简要综述并提出自己对一些问题的看法。
（3）课题研究方案：包括研究内容、研究方法和技术路线。
研究内容要重点突出；研究方法要具有科学性、先进性；技术路线有清晰。
（4）研究的预期结果和创新性。
3、格式要求（1）表格内容，字号用小4号，中文字体用宋体，英文字体、数字用Times New Roman；（2）正文字数1500字以上。
4、内容要求（1）立题依据充分（实验目的明确、意义定位准确，对拟解决的问题有合理预测，对国内外研究现状阐述全面）；（2）研究方案（包括实验的技术路线、实验的进程安排、具体操作过程、设立的实验指标和指标的检测手段）可操作性强；（3）实验结果的记录及分析方法可行性强；（4）对实验中可能发生的问题有正确预测并提出相应的解决方法；（5）经费预算合理；（6）附有5篇以上主要参考文献。
三、实验设计题目（自拟）一、选题依据（拟开展研究项目的目的、意义）实验目的1、掌握孚尔根反应和Brachet反应的原理。
2、掌握孚尔根反应和Brachet反应显示细胞内DNA的方法。
实验室规那么和要求一般规定1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“平安〞是进展任何实验最重要的事项。
2.在实验室内请穿著实验衣〔最好长及膝盖下〕，防止穿著凉鞋、拖鞋〔脚趾不要裸露〕。
留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。
3.在实验室内制止吸烟、吃东西、饮食、化装、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外套及杂物等。
4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。
每组分配之仪器、耗材请在课程开场前确定清点与保管，课程完毕后如数清点缴回。
公用仪器请善加爱惜使用。
实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境清洁。
5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的考前须知。
实验进展中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。
打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。
实验后，适切记下自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。
6.身体不适、睡眠缺乏、精神不济或注意力无法集中，请立即停顿实验。
实验时间假设延长，请注意时间的管制及自身的平安，不可自行逗留实验室。
7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验室前记得洗手。
8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变措施。
药品1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、考前须知，翻阅物质平安资料，查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。
2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、考前须知及配制日期，为防止污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。
3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂〔如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、-巯基乙醇、甲醛、酚等〕要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，假设不小心打翻试剂，马上处理。
4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺〔神经毒〕、溴化乙啶〔突变剂〕、SDS〔粉尘〕请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好习惯。
首都师范大学生物实验报告科目：细胞生物学班级：师范班姓名：王攀学号：1110800065 实验名称：核酸(DNA and RNA)的细胞核定位观察日期：10.16一、实验目的：1 、掌握细胞水平的核酸（DNA、RNA）固定、染色、分色的基本原理和方法；2 、验证性实验是成熟实验，所以一定要快且有结果。
二、实验原理：1、Unna染色法原理：核酸是酸性的，它们对于碱性染料具有亲和力，但是DNA和RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。
DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。
2、固定的目的和意义：为了使切取的标本最终能真实地反映其生活状态下正常的结构，必须用物理或者化学的手段迅速地杀死组织和细胞，使组织和细胞中的各种细胞器以及大分子保持生活状态的结构，并牢固地固定在其以原来的位置上。
3、分色剂：根据染液浓淡及是否使用分色剂而分，显色法可以分为：渐进法（累积法）：染色液较淡，材料放入较长时间，使其慢慢染至合适为止。
后退法（回复法）：将材料置浓染色液中使其过度染色，然后以分色剂使其退色至适度，这种退色称分色。
4、设计对照实验：设计对照实验目的：证明和肯定实验结果的特异性和准确性。
阳性对照：用确证含染色对象的标本作对照，实验结果应呈阳性结果；当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要，用以排除假阴性。
阴性对照：用确证不含染色对象的标本作对照，实验结果应呈阴性结果；当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。
5、核酸（DNA和RNA）的分子组成：一个核苷酸是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。
DNA是染色体的主要成分，主要在细胞核质内呈双螺旋结构。
RNA是单链线形，主要有三种类型:（1）rRNA含量大，占细胞RNA总量的80％左右，是核糖体的重要组成部分，而rRNA的合成、加工和核糖体大、小亚单位的装配都是在核仁中进行的。
山东大学细胞生物学实验报告
蟾蜍红细胞甲基绿—派洛宁染色
姜政2012/10/9
实验目的：
学习用甲基绿—派洛宁染色观察验证蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布，掌握血涂片制作，了解甲基绿—派洛宁染色的基本原理和应用以及细胞化学的基本概念。
实验原理：
核酸（脱氧核糖核酸，DNA；核糖核酸，RNA）的结构单体核苷酸由核糖、碱基和磷酸基团构成。
由于嘌呤碱基和嘧啶碱基环上都有含孤对电子的N，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤都含有-NH2，因此，在水溶液中，核苷酸碱基（图1）上这些含有孤对电子的N既可以接受质子（-NH2+H+→-NH3+，N：+H+→N+:H），也可以释放质子（-NH3+→-NH2+H+，N+:H- H+→N：+H+）。
通常，核苷酸中的磷酸基团存在两步解离，且碱基N上H+的解离常数在磷酸基团一级解离（-PO3H2→-PO3-H+H+）常数和二级解离（-PO3-H→-PO32-+H+）常数之间，所以，当磷酸基团一级解离与碱基N上H+的解离恰好使核苷酸静电荷为零时，核苷酸就达到了等电点。
因此，在水溶液中，核酸分子可以被看作是两性电解质，由于DNA与RNA的组成不同，两者等电点不同，在同一份溶液中的电性就略有不同。
图1. 五种核苷酸碱基的结构和孤对电子示意图（左，引自Stacey D. Wetmore等，2000）和甲基绿、派洛宁的分子结构（右）。
甲基绿（Methyl Green）和派洛宁（Pyronin）都是具有芳香体系且能够发生电离的染料分子（图1），在水中发生电离后都成为带正电的分子。
因此，甲基绿和派洛宁都是碱性染料，专染酸性核酸分子。
电离后的甲基绿分子带两个正电荷，派洛宁分子带一个正电荷。
这种电荷上的差异使两种染料分子具有不同的染色性质。
加之两种染料分子具有完全不同的颜色（甲基绿是亮绿色，派洛宁是红色），两种染料配合使用的染色剂（Unna试剂）很早就成为区分细胞中DNA与RNA分布的常用试剂[1]。
甲基绿-派洛宁对核酸着色的机理可以分解为两步，第一步是电荷相互作用下染料分子向特定核酸分子的靠近，第二步是疏水相互作用下染料分子与核酸分子的结合[2,3]。
在适当的PH（约4.8）下，核酸分子带负电，染料分子带正点，这是保证染料分子与核酸分子有效结合的关键条件。
在染料与核酸分子的具体结合方式这个问题上，有人认为是带正电的染料分子与核酸带负电的磷酸基团结合，形成了盐[4]。
甲基绿和派洛宁分别对DNA和RNA的特异性结合可能是由DNA和RNA不同的聚合度造成的。
由于DNA的双螺旋结构，其负电荷密度要比以单链形式为主的RNA大，因此更易与具有两个正电荷，正电荷密度更高的甲基绿结合。
在甲基绿-派洛宁染液的使用过程中，J. Goldstein发现不同配比的染液能够区分mRNA和rRNA，以及解链的DNA分子[5]。
也有人尝试利用甲基绿-派洛宁染液定量测定不同细胞中DNA 和RNA的相对含量[6]。
材料、试剂：
蟾蜍血液，甲基绿-派洛宁染液，70%乙醇溶液，95%乙醇溶液
实验方法：
取新鲜蟾蜍血液制血涂片，空气中干燥后以70%乙醇固定10min，晾干。
在玻片血膜上滴加足量甲基绿-派洛宁染液，染色15min，以蒸馏水冲洗去除染液。
滴加95%乙醇分色，晾干玻片，进行观察。
实验结果：
A B
C D
图2. 甲基绿-派洛宁染色的蟾蜍血涂片。
A,B,C (400×)显示多数红细胞细胞质被染成淡红色或橙色，细胞核染为蓝绿色；D (1000×)显示部分红细胞发生胞质间融合（图中短箭头）。
讨论：
从染色结果来看，多数血涂片染色后只显示一种颜色，能够区分出两种颜色的涂片（图2）色彩也偏于暗淡。
在所用两种不同配比的甲基绿-派洛宁染液中，前者染出的涂片普遍偏绿，后者染出的涂片普遍偏红，两种染液对DNA和RNA的特异性区分都不好。
因此，除去可能是分色过度导致的色彩饱和度降低（图2），本次染色不理想更可能的原因是甲基绿和派洛宁染料的相对浓度和染液的PH不合适，因为这两个因素被认为是保证染色效果的关键[1]。
图3. 标准配比甲基绿-派洛宁染液在不同PH条件下染色15min的效果（引自P. Prento等，2003）。
鉴于不同PH条件下标准甲基绿-派洛宁染液的染色结果并没有出现全绿的情况（图3），实验中出现最多的全部染绿的结果应该是由染料配比不合适造成的。
其次，由于派洛宁比甲基绿更易溶于乙醇，95%乙醇分色的过程可能导致了派洛宁在血涂片上的彻底清除。
血涂片上个别红细胞的融合（图2，D）可能是在没有抗凝剂的情况下，新鲜的血液发生的自发性溶血。
红细胞之间的融合可能与细胞死亡时细胞内破裂的溶酶体有关。
玻片上同一区域不同细胞间着色的差异（图2，A-C）表明了RNA含量的差异，可能与细胞间不同的“年龄”，即不同的代谢活性有关。
参考文献：
1. P Prento and Ho Lyon. Methyl green-pyronin Y staining of nucleic acids: studies on the effects of staining time, dye composition and diffusion rates. Biotech and Histochem, 2003, Vol. 78, 27-33.
2. P Prento. Staining of macromolecules: possible mechanisms and examples. Biotech and Histochem, 2009, Vol. 84, 139-158.
3. P Prento. A contribution to the theory of biological staining based on the principles for structural organization of biological macromolecules. Biotechnic and Histochemistry, 2001, Vol. 76, 137-161.
4. Arthur W. Pollister and Cecilie Leuchtenberger. The Nature of The Specificity of Methyl Green for Chromatin. Proc. N. A. S, 1949, Vol. 35, 111-116.
5. D. J. Goldstein. Mechanism of differential staining of nucleic acids. Nature, 1961, Vol. 191, 407-408.
6. Seymour Perry, John Reynolds and Mary Baker. Methl-Green-Pyronin as a differential Nucleic Acid Stain for Peripheral Blood Smears. Blood, 1956, Vol. 11, 1132-1139.
7. Stacey D. Wetmore, Russell J. Boyd, Leif A. Eriksson. Electron affinities and ionization potentials of nucleotide bases. Chemical Physics Letters, 2000, Vol. 322, 129–135.。
