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2013版苏微黄曲霉毒素M1免疫亲和柱使用说明书【产品用途】免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素M1, 从而对黄曲霉毒素M1样品起到特异性的纯化作用, 过柱净化后的样品液可直接用于高效液相色谱进行黄曲霉毒素M1含量的检测。
亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的, 以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。
【产品性能】柱吸附能力：≥100ng/支；回收率：75%~90%。
【测定原理】本产品测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素M1（AFM1）单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFM1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFM1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFM1与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。
最后采用乙腈洗脱AFM1，然后进行相关分析。
【产品组成】标准品（选配）；20支/盒，3mL柱管/支说明书1份；【所需材料】（不提供）（1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、高速均质器（18000r/min~22000 r/min）；量筒、50mL 玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸（whatman934-AH，直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。
（2）试剂：乙腈（色谱级）、蒸馏水或去离子水。
【样品制备及净化】----乳：将试样在水浴中加热至35℃~37℃。
用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。
至少收集20mL试样。
----乳粉：称取10g样品（精确至0.01g）,置于250mL 的烧杯中。
将50mL已预热到50℃的水加入乳粉中，搅拌溶解。
若乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴中放置至少30min，仔细混匀。
将溶解的乳粉冷却至20℃，移入100ml容量瓶中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。
用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。
多功能净化柱和免疫亲和柱工作原理
（黄曲霉毒素检测）
PriboFast 系列多功能净化柱分为柱压型（带玻璃试管）和推杆型（针筒式）
两种，以极性、非极性及离子交换等基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的
脂类、蛋白质类等杂质，毒素不被吸附而直接通过，其操作更为简便，不需要
进行活化、淋洗和洗脱操作，只需要直接上样，30秒钟即可完成整个净化过程，效果理想，可同时净化多种毒素，降低检测成本，有效提高检测效率，稳定性强，回收率高，适用于食品、粮食饲料、饮料、中药材等多种复杂样品。
同时
我们还提供多毒素符合免疫亲和柱。
PriboFast®免疫亲和柱利用抗原抗体特异性可逆结合的原理, 将抗体与凝胶共价结合，然后填充柱子。
将样品提取溶液过免疫亲和柱,而非目标化合物则沿柱流下,最后用洗脱缓冲液洗脱抗原,从而得到纯化的抗原。
其提纯效率很高,适用于
各类复杂样品包括食品、饲料等多种基质。
整个纯化过程30分钟左右。
黄曲霉毒素M1免疫亲和柱工作手册一、溶剂的配置和准备：1．蒸馏水/去离子水（配合液相使用）；2．色谱级甲醇、乙腈；3．磷酸盐缓冲液1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
4．黄曲霉毒素M1标准品（货号：TSL-143，浓度为0.5 μg/ml）5．氢氧化钠、浓盐酸（用于调节pH）二、其他耗材及设备的准备1.滤纸；2.免疫亲和柱架或固定支座；3.注射器（建议玻璃材质，易于清洗，10 ml）或5 ml或10 ml枪头；4.1升容积的搅拌器；5.离心机；6.量筒，漏斗，移液管，烧杯，带螺盖的瓶子等玻璃器具；三、标准曲线的配制：黄曲霉毒素M1总量液态标准品：500 ng/ml 100%乙腈溶液。
取100μl 500 ng / ml溶液加入甲醇：乙腈：水溶液20:30:50 v/v/v至500μl，得到100ng/ml 的溶液。
绘制一条3点的校准曲线：取50 μl 100 ng / ml溶液加入甲醇：乙腈：水溶液20:30:50 v/v/v至2.5 ml（=2 ng / ml）。
取1 ml 2 ng / ml溶液加入甲醇：乙腈：水溶液20:30:50 v/v/v至2 ml（=1 ng / ml）。
取1 ml 1 ng / ml溶液加入甲醇：乙腈：水溶液20:30:50 v/v/v至2 ml（=0.5 ng / ml）。
每种取100 μl注射进HPLC系统。
四、样品回收率的测定--针对奶粉添加浓度为0.5 ppb的样品：取50 μl浓度为100 ng/ml的标准品溶液，加入到10 g阴性奶粉样品中，（此样品最后上HPLC 的浓度相当于1 ng/ml）--针对奶添加浓度为0.1ppb的样品：取50 μl浓度为100 ng/ml的标准品溶液，加入到50ml阴性奶样品中，（此样品最后上HPLC 的浓度相当于2 ng/ml）五、样品处理A）牛奶-- 加热牛奶至35 - 37 ℃，用Waterman 4号滤纸或者Waterman 113号滤纸过滤或者在4000 rpm下离心15分钟。
黄曲霉毒素M1检测方案方案一、免疫亲和层析净化高效液相色谱法（GB 5413.37-2010第二法）一、原理：亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当试样通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体—抗原复合体。
用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液。
用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。
二、所需仪器1、高效液相色谱仪（配荧光检测器—具有365 nm激发波长、435 nm发射波长，在适当的色谱条件下能够测定0.02 ng 的黄曲霉毒素M1(相当于5倍噪音)）2、离心机（转容50ml角转子，转速10000r/min）3、氮吹仪4、固相萃取装置（带真空系统）5、水浴锅（温控30℃±2℃，50℃±2℃；温范25℃~60℃）6、天平：感量为0.01 g7、PH计：精度0.018、旋转蒸发仪（奶油样品制备）9、紫外分光光度计（标液浓度的校正，波长范围为200nm~400nm）三、试剂及耗材1、黄曲霉毒素M1免疫亲和柱2、黄曲霉毒素M1标准品3、反相色谱柱C18 4.6*250 加有反相色谱材料的保护柱5、移液管：1ml, 2ml, 50ml6、烧杯：50ml, 250ml7、分液漏斗：250ml（干酪和奶油样品制备）8、容量瓶：100ml9、一次性注射器：10ml, 50ml10、针式过滤器（水系）0.22um，Φ1311、乙腈(CH3CN)：色谱醇12、甲醇：分析醇13、三氯甲烷：分析醇14、石油醚：分析醇15、带刻度的磨口锥形玻璃试管：5 mL、10 mL、20 mL16、离心管：50ml四、操作方法依据GB 5413.37-2010第二法方案二、酶联免疫吸附法（可定性、定量检测牛乳及其他乳制品等样本中的黄曲霉毒素M1）一、原理标准溶液和样品试液加入各自板孔，游离的黄曲霉毒素M1与微孔中包被的黄曲霉毒素M1抗体结合，没有结合的物质在洗涤中被清除。
PriboFast IAC 中文说明书产品产品用途用途用途：：免疫亲和层析柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素M1，从而对黄曲霉毒素M1样品起到非常针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直接用于液相进行黄曲霉毒素M1含量的检测。
亲和层析柱与HPLC 配合使用可达到快速测定的目的，以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。
产品产品概述概述概述：：黄曲霉毒素（AFT ）是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，是一种毒性极强的剧毒物质.黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至死亡, 黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。
牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素M1污染的食品之一。
反应反应原理原理原理：：测定的基础是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过黄曲霉毒素M1免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用甲醇洗脱黄曲霉毒素M1，然后注入到分析仪器中用于检测。
适用范围及性能 适用于定性、定量检测牛奶，奶粉，发酵乳，干酪，奶油等样品中黄曲霉毒素M1的样品前处理。
柱容量柱容量≥≥200ng 200ng 回收率回收率≥≥90% 产品产品包装组成包装组成包装组成：：每一个盒中包括25支/50支黄曲霉毒素M1免疫亲和层析柱及1份说明书。
需要的材料但盒中不提供需要的材料但盒中不提供：： 设备 器皿耗材 试剂 HPLC 泵流操作架 空气泵 天平 匀质器 高速粉碎机 超声波发生器 100ml/10mL 量筒 50ml 漏斗 玻璃针筒 样品瓶 100ml/1L 容量瓶 移液器或移液管 50ml 离心管 定量滤纸 玻璃纤维滤纸 圆孔筛 氯化钠(分析纯) 氢氧化钠浓盐酸(分析纯)色谱甲醇色谱乙腈蒸馏水或去离子水 黄曲霉毒M1标准品 石油醚注意事项注意事项：： ----黄曲霉毒素对人体有害，应戴手套操作。
1. 目的：建立黄曲霉毒素测定标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：2.1. 《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用黄曲霉毒素测定法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.内容：5.1. 本法系用高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
5.1.1. 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40：18：42）为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长γex =360nm（或365nm），发射波长γem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
5.1.2. 混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B 1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
5.1.3. 供试品溶液的制备：取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2013版苏微黄曲霉毒素B1免疫亲和柱使用说明书【产品用途】黄曲霉毒素B1（AFB1）免疫亲和柱适合于和AFB1酶免分析试剂盒、HPLC或液质结合使用，定量检测AFB1。
用该免疫亲和柱净化样品，提高了样品的纯度。
纯化后的样品可用不同的分析方法测定。
【适应范围及产品性能】用于定性、定量检测谷物、粮油、饲料等样本中AFB1时的样本前处理。
柱吸附能力：≥100ng/支（可根据要求选择相应柱容量）；回收率：75%~90%。
柱内凝胶：Protein A琼脂糖凝胶特点：载量大，单抗定向偶联，易洗脱，回收率高。
【测定原理】本产品测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素B1（AFB1）单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFB1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFB1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFB1与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。
最后采用甲醇洗脱AFB1，然后进行相关分析。
【产品组成】标准品（选配）。
25支/盒，1mL柱管/支；20支/盒，3mL柱管/支。
说明书1份。
【所需材料】（不提供）（1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、高速均质器（18000r/min~22000 r/min）；量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。
（2）试剂：甲醇（色谱级）、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、pH7.0磷酸盐缓冲液（PBS）、吐温-20、蒸馏水或去离子水。
【样品制备及净化】（1）谷物、花生及其制品----准确称取25.0g粉碎的样品，加入5.0g氯化钠，----与125.0mL甲醇-水溶液（7+3）混合，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min，----用定量滤纸过滤，----准确移取15mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。
----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。
苏微黄曲霉毒素总量（B1、B2、G1、G2）免疫亲和柱说明书1、用途：免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2, 从而对黄曲霉毒素样品起到特异性的纯化作用, 过柱净化后的样品液可直接用于高效液相色谱进行黄曲霉毒素含量的检测。
亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的, 以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。
2、产品性能柱吸附能力：≥100ng/支；回收率：75%~90%。
3、测定原理：测定的基础是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2经过提取、过滤、稀释，然后缓慢的通过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，免疫亲和柱中抗体与毒素结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用乙腈洗脱黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，然后注入到分析仪器中用于检测。
4、包装组成：标准品（选配）；20支/盒，3mL柱管/支说明书1份；5、需要的材料但盒中不提供：5.1设备----HPLC----气控操作架----空气泵----天平----组织匀浆机（或摇床）----粉碎机----分样筛----100mL/10mL量筒----50mL漏斗----针筒----快速定性滤纸----微纤维滤纸（Whatman 934-AH）----样品瓶----转接头（配3ml免疫亲和柱使用）5.2 试剂----甲醇，氯化钠，乙腈，蒸馏或去离子水。
6、注意事项：----黄曲霉毒素可致癌，应戴手套操作。
----使用过的容器及黄曲霉毒素溶液最好用次氯酸钠溶液（5%,V/V）浸泡过夜。
----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。
----2~8℃储存，不得冻存。
----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22~25℃）7、样品处理：方法：适用于玉米、花生或中药等样品----玉米花生或中药等样品粉碎，过2mm分样筛；----25g过筛粉碎的样品加入5g 氯化钠与125mL 60%甲醇-水溶液混匀；----高速匀浆1min（或用摇床剧烈振荡20min），用快速定性滤纸过滤；----用20mL蒸馏水稀释10mL滤液，再用微纤维滤纸过滤；----取15mL上样检测。
总黄曲霉毒素免疫亲和柱总黄曲霉毒素（Aflatoxin B1，AFB1）是一种由黄曲霉菌（Aspergillus flavus）和黄曲霉素菌（Aspergillus parasiticus）产生的一种强烈致癌的化合物。
该化合物在人类和动物体内会引起多种癌症，如肝癌、食管癌、胃癌等。
因此，检测和去除环境和食品中的总黄曲霉毒素对于保障人类健康至关重要。
为了检测和去除总黄曲霉毒素，研究人员开发了多种方法，其中之一就是使用总黄曲霉毒素免疫亲和柱。
这种免疫亲和柱是通过利用特异性抗体对总黄曲霉毒素进行捕捉，从而实现检测和去除的目的。
总黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备过程通常包括以下步骤：首先，需要获得针对总黄曲霉毒素的特异性抗体。
这可以通过免疫小鼠（如小鼠、兔子等）或体外合成的方法获得。
然后，将抗体与固相材料（如琼脂糖、硅胶等）结合，形成免疫亲和柱。
接下来，将待测样品加入免疫亲和柱中，允许总黄曲霉毒素与抗体结合。
最后，用适当的缓冲液洗脱并收集样品，得到含有总黄曲霉毒素的纯净溶液。
总黄曲霉毒素免疫亲和柱的检测原理是基于特异性抗体与总黄曲霉毒素的亲和作用。
一旦待测样品中存在总黄曲霉毒素，它们会与免疫亲和柱中的抗体结合。
通过洗脱的步骤，可以将结合的总黄曲霉毒素从样品中分离出来，从而完成检测过程。
除了检测相关，总黄曲霉毒素免疫亲和柱还可以用于去除总黄曲霉毒素。
已经结合总黄曲霉毒素的免疫亲和柱可以用于净化食品和饲料，去除其中的毒素。
这是因为抗体与毒素之间的结合力较强，可以有效地捕捉和去除总黄曲霉毒素。
总的来说，总黄曲霉毒素免疫亲和柱是一种有效的工具，可以用于检测和去除环境和食品中的总黄曲霉毒素。
通过结合特异性抗体和固相材料，免疫亲和柱可以捕捉和去除总黄曲霉毒素。
然而，需要注意的是，免疫亲和柱的制备过程较为繁琐且耗时，因此需要进行全面的实验准备和操作。
对于总黄曲霉毒素的免疫亲和柱的研究和应用仍在不断发展中。
随着技术的不断进步，相信将有更多的改进和创新，提高总黄曲霉毒素的检测和去除效果，进一步保障人类的健康安全。
抗黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的制备孙兴荣1，裴世春2，柳家鹏3，王莹3（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）（2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）（3.北京华安麦科生物技术有限公司，北京 102200） 摘要：制备黄曲霉毒素M1污染样品的净化前处理免疫亲和柱。
利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B进行偶联、装柱后通过IC-ELSIA对免疫亲和柱的性能评价确立了最佳反应条件。
免疫亲和柱的有效柱容量为500 ng，经添加回收试验测定的平均回收率为92.46%,变异系数2.3%~7.2%。
利用高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B制备的免疫亲和柱可应用于乳制品等食品中黄曲霉毒素M1污染度测定的样品快速前处理。
关键词：黄曲霉毒素M1；免疫亲和柱；无血清培养基文章篇号：1673-9078(2011)3-306-309Preparation of Immunoaffinity Column for Anti-AFM1SUN Xing-Rong1, PEI Shi-Chun2, LIU Jia-Peng3, W ANG Ying3(1.Food Science College, Heilongjiang August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China)(2.Food and Biological Engineering College, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)(3.Beijing Hua’an Magnech Bio-Tech Co., Ltd, Beijing 102200, China)Abstract: Preparation of aflatoxin M1 immunoaffinity column for clean-up contaminated samples. The high-purity anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with serum-free medium was prepared and coupled with CNBr activated Sepharose 4B, and then packed in a column. Then the column was evaluated through IC-ELISA and established the optimum reaction conditions. The capacity of immunoaffinity column was 500 ng, the average recovery of aflatoxin M1 was 92.46%; and the variation coefficients were 2.3%~7.2%. The immunoaffinity columns was prepared by coupling high-purity anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with CNBr Activated Sepharose 4B can be applied to detect contamination samples fast, such as aflatoxin M1 in dairy products.Key words: aflatoxin M1; immunoaffinity column; serum-free medium黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF）是食品中广泛存在的一种高致癌性真菌毒素，是Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus 的二次代谢产物，黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是动物摄入黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)后在体内经羟基化而形成的产物，主要存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类等，其中以乳最为常见[1~3]。
黄曲霉毒素M1的检测国家新标准GB 5413.37-2010[4]中对乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的检测方法有“免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法”、“免疫亲和层析净化高效液相色谱”、“免疫亲和层析净化荧光分光法”、“双流向酶联免疫法”等4种，其收稿日期：2010-11-17基金项目：黑龙江省留学归国人员基金（Lc05c11）作者简介：孙兴荣（1984-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全检测 通讯作者：裴世春（1966-），男，教授，博士，研究方向：真菌毒素快速检测技术 中多数测定方法均要使用以抗黄曲霉毒素M1抗体为基础的免疫亲和层析技术。
本研究利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为基础，制备了免疫亲和柱，并对其性能进行了分析。
1 材料和方法1.1 试验材料1.1.1 实验试剂抗黄曲霉毒素M1（AFM1）单克隆抗体由本实验室自制；AFM1人工抗原购自Sigma公司；Aflatoxin M1购自FERMENTEK公司；OPD、羊抗鼠IgG-HRP 酶标二抗购自Sigma公司；CNBr活化的SepHarose 4B 购自PHarmacia公司；亲和柱柱管购自深圳逗点公司；96孔酶标板购自Costar公司；Protein A（SPA）亲和柱等购自Sigma公司；MD6无血清哺乳细胞培养基购自上海麦伯星生物科技有限公司，DMEM培养基购自306307Invitrogen 公司；优级胎牛血清（FBS ）购自中国医学院生物医学工程研究所灏洋生物制品科技有限责任公司；其他分析和有机试剂均为优级以上。
1.1.2 试验仪器与设备酶标仪为瑞典TECAN 公司产品；JK04S 凝胶成像系统为北京君意东方电泳设备有限公司产品；低温高速离心机为Thermo 公司。
96孔洗板机（美国 Skan Wahser400），96孔加样机（Costar Transtar-96），全自动加样机（Genetix QFill3），微孔板分液器（Biotex ，Ufill ），HL-恒流泵（上海），Stirred ultrafiltration cells(美国 Millipore)，超净工作台（美国Purifier Logic A2），微量紫外分光光度计（GE Nano-Drop ），精密分析天平（瑞士Metter ），细胞离心机（德国Eppendorf ），灭菌器（TMQ.C5090，山东新华）等。
1.2 实验方法1.2.1 抗AFM1单克隆抗体的纯化将分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞用200 mL 的MD6无血清培养基扩大培养至96%以上的细胞死亡后，取培养基利用protein A 亲和层析，利用Stirred ultrafiltration cells 进行浓缩后分装待用[5]。
1.2.2 AFM1单克隆抗体的免疫亲和柱的制备参照CNBr 活化的Sepharose 4B 胶产品说明书略作修改，具体操作步骤如下： 1.2.2.1 洗涤将CNBr 活化的Sepharose 4B 干胶悬浮于 1 mmol/L HCl 中溶涨，砂芯漏斗中快速抽洗15 min 。
1.2.2.2 偶联将预处理的胶迅速转移至含有AFM1单抗的偶联缓冲液中（0.1 mol/L NaHCO 3，0.5 mol /L NaCl ，pH 8.3），室温1 h 或4 ℃过夜温和搅拌，使AFM1单克隆抗体与CNBr 活化的Sepharose 4B 充分偶联。
用大于5倍凝胶体积的偶联缓冲液洗去未偶联的抗AFM1抗体，收集全部洗脱液，紫外分光光度计测定洗脱液中未偶联蛋白含量，计算偶联率[6-7]。
1.2.2.3 封闭0.1 mol /L pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液室温封闭2 h 。
1.2.2.4 洗涤用约5倍体积的0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 4.0，含0.5 mol/L NaCl ）和0.1 mol /L Tris-HCl （pH 8.0，含0.5 mol /L NaCl ）先后交替洗涤4~6次。
1.2.2.5 装柱取1 mL 柱管，垫好筛板，将PBS 缓冲液（0.01 mol /L pH 7.4）悬浮的偶联胶装柱，至胶高度为0.5 mL ，PBS 平衡，封住口底，冰箱4 ℃保存。
1.2.3 上样缓冲液pH 值的选择平衡缓冲液冲洗涤柱胶，分别以1 mL （AFM1的含量为200 ng ）pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8的上样缓冲液以3 mL/min 的流速流过免疫亲和柱，收集通过柱体的上样缓冲液，用IC-ELISA 方法测定收集液中的AFM1含量，进而确定最优pH 值. 1.2.4 上样缓冲液流速的选择AFM1的上样量为200 ng ，分别以0.5 mL/min 、1 mL/min 、2 mL/min 、3 mL/min 、4 mL/min 、5 mL/min 、6 mL/min 的流速通过柱体，经洗涤收集洗脱液，IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM1含量，进而确定上样缓冲液的最佳流速。
1.2.5 洗脱条件的选择AFM1的上样量为200 ng ，分别用3 mL 60%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、80%甲醇-水溶液、90%甲醇-水溶液、纯甲醇-水溶液进行洗脱，收集洗脱液，用IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM1含量，进而确定最优洗脱条件。
1.2.6 样品加标回收率的测定分别将100 ng/mL~500 ng/mL 的AFM1标准品加入到预处理的的鲜奶样品中，将溶液以3 mL /min 的流速通过免疫亲和柱，超纯水洗涤后，3 mL 90%的甲醇-水溶液进行洗脱，IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM1含量，每个浓度作3次平均实验，计算加标回收率。
2 结果与分析2.1 抗AFM1单抗纯化效果的评价图1 无血清培养基和小鼠腹水制备的抗AFM1单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE patterns of the anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with serum-free medium and mouse ascites with orwithout purification注：1.无血清培养基制备的AFM 1单抗；2.小鼠腹水制备的单抗；3.Marker 。
