多功能净化柱和免疫亲和柱工作原理

免疫亲和柱使用方法
免疫亲和柱是一种常用的分离纯化蛋白质的工具，其原理是利用抗体与目标蛋白质的特异性结合，将目标蛋白质从混合物中分离出来。

下面将介绍免疫亲和柱的使用方法。

一、实验前准备
1. 准备所需的免疫亲和柱、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、目标蛋白质混合物和其他必要的实验用品。

2. 检查免疫亲和柱是否完整，无损坏或泄漏。

3. 在使用前，将免疫亲和柱放置在4℃下保存，以保持其稳定性。

二、样品处理
1. 样品处理前，应将目标蛋白质从细胞或组织中提取出来，并进行初步的纯化。

2. 样品中应去除杂质，如细胞碎片、核酸、脂质等。

3. 样品应在适当的缓冲液中进行处理，以保持其稳定性和活性。

三、免疫亲和柱的使用
1. 将免疫亲和柱放置在离心管中，并加入足够的洗涤缓冲液，使其完全润湿。

2. 将样品加入免疫亲和柱中，并让其在室温下静置一段时间，以便抗体与目标蛋白质结合。

3. 将未结合的蛋白质和其他杂质用洗涤缓冲液洗掉，以保持免疫亲和柱的纯度。

4. 用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质，以得到高纯度的目标蛋白质。

四、注意事项
1. 在使用免疫亲和柱前，应先进行实验室安全培训，并遵守实验室安全规定。

2. 在使用免疫亲和柱时，应注意避免柱子干燥，以免影响其性能。

3. 在使用免疫亲和柱时，应注意洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的浓度和pH
值，以保证其最佳效果。

4. 在使用免疫亲和柱时，应注意避免样品中的高浓度盐类和其他杂质，以免影响柱子的性能。

总之，免疫亲和柱是一种非常有用的分离纯化蛋白质的工具，其使用
方法简单易行，但需要注意一些细节问题，以保证其最佳效果。

液相色谱-质谱-质谱联用仪测定花生油中黄曲霉毒素B1周　琴，刘新月*，李绍仙，张晓花，谭文涵（普洱市质量技术监督综合检测中心，云南普洱 665000）摘　要：目的：采用液相色谱-质谱-质谱联用仪建立花生油中黄曲霉毒素B1的检测方法。

方法：样品提取经免疫亲和柱净化，以甲酸水和乙腈为流动相，采用phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A色谱柱（100 mm×3.0 mm）梯度洗脱分离，多重反应监测模式对花生油中黄曲霉毒素B1进行定性分析，同位素内标法定量。

结果：黄曲霉毒素B1在1～20 ng·mL-1线性内呈良好线性关系（R2为0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加标水平下，回收率在94.1%～107.4%，相对标准偏差（n=6）为5.6%～9.3%，采用该方法测定花生油中黄曲霉毒素B1质控样，检测结果在质控样范围内。

结论：该检测方法简便快捷、无需衍生、特异性强，灵敏度高且线性关系良好，准确度和精密度均满足定量分析的要求，适用于花生油中黄曲霉毒素B1的定量分析。

关键词：液相色谱-质谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）；黄曲霉毒素B1；花生油Determination of Aflatoxin B1 in Peanut Oil by LC-MS-MS ZHOU Qin, LIU Xinyue*, LI Shaoxian, ZHANG Xiaohua, TAN Wenhan(Pu’er Comprehensive Technical Testing Center, Pu’er 665000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of aflatoxin B1 in peanut oil by LC-MS/MS. Method: The sample was extracted and purified by an immunoaffinity column. Formic acid water and acetonitrile were used as mobile phases, and the gradient elution separation was carried out on the phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A chromatographic column (100 mm×3.0 mm).The qualitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil was carried out by multiple reaction monitoring mode, and the quantity was determined by isotope internal standard. Result: Aflatoxin B1 showed a good linear relationship in the linear range of 1～20 ng·mL-1 (R2=0.999 3）, at the spiked levels of 2.0 μg·kg-1, 5.0 μg·kg-1 and 10.0 μg·kg-1, the average recovery rate was 94.1%～107.4%, and the relative standard deviation (n=6) was 5.6%～9.3% . The method was used to determine aflatoxin B1 quality control samples in peanut oil, and the detection results were within the range of quality control samples. Conclusion: This detection method is simple, fast, does not require derivatization, has strong specificity, and has high sensitivity and good linear relationship. The accuracy and precision meet the requirements of quantitative analysis, and is suitable for the quantitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil.Keywords: liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); aflatoxin B1; peanut oil花生油含有丰富的不饱和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白胆固醇水平，而不会破坏高密度脂蛋白，有助于维持血脂平衡，预防心血管疾病[1]。

除快检产品外，目前针对毒素检测常用的前处理产品是免疫亲和柱，其特点是特异性强，利用抗原抗体的特异性结合达到目标物富集再洗脱的效果。

但如果我的样品比较多，希望方法上操作更简单，时间上更快且可定量计算怎么办？今天小编就给大家介绍一下专为食品和饲料中毒素检测而生的多功能净化柱，通过一步30s 完成净化，满足您的实验需要。

那对于多功能净化柱，您了解多少？跟着小编来学一学吧！01产品基本原理是什么？以极性、非极性及离子交换等基团组成的填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白质类等杂质，毒素不被吸附而直接通过从而达到分离纯化效果。

02产品怎么选择？基于原理，我们的产品均是根据检测的目标物来进行相应的命名，所以您只需要以检测物来选择就可以。

举例您要同时检测黄曲霉毒素（B、G、M）、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮，可以选择我们对应规格的CNW 301多功能净化柱即可。

而多功能净化柱的外观形式通常有柱塞型（带试管）和推杆型（针筒式），分别是正向挤压和针筒推的方式，除了与各人使用习惯有关，当样品量比较少时可选择小体积推杆型的，结合以上2点您可完美选择所需要的产品。

03如何操作？以柱塞型226黄曲霉毒素净化柱为例：步骤1：向试管中加入5m L 样品提取液步骤2：将净化柱橡胶头从试管顶端插入试管中，并向下压净化柱至试管底端Tip：按压过程中请留意不要过度用力，正常下压至底部即可。

若按压压力过大使得气体压力太大，导致橡胶塞回弹，液体会进入试管造成漏液现象。

步骤3：将净化柱上部净化后的样品提取液倒出至样品瓶或EP管中Tip：净化后上层液体请及时转移，不宜长时间浸泡在管子中以免使得杂质再次进入净化液造成净化不彻底。

步骤4：取2m L 净化提取液，氮吹至干，用1m L 或0.5m L 初始流动相复溶，过微孔滤膜，上机分析Tip：CNW 多功能净化柱是基于液相方法开发应用，适用于大部分客户实验室，同样液质也完全满足。

操作示意图04产品适用标准上海安谱实验科技股份有限公司，于1997年组建成立，总部位于上海，目前拥有500多位员工，2018年销售额超过5亿人民币；是中国领先的实验用品供应链管理服务商；目前公司已是集研发、生产与销售以及客户供应链管理为一体的综合性企业；主要产品包括化学试剂、标准品、气相色谱相关耗材、液相色谱相关耗材、样品前处理产品、实验室通用耗材、小型仪器等。

2013版苏微黄曲霉毒素M1免疫亲和柱使用说明书【产品用途】免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素M1, 从而对黄曲霉毒素M1样品起到特异性的纯化作用, 过柱净化后的样品液可直接用于高效液相色谱进行黄曲霉毒素M1含量的检测。

亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的, 以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。

【产品性能】柱吸附能力：≥100ng/支；回收率：75%~90%。

【测定原理】本产品测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素M1（AFM1）单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFM1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFM1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFM1与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。

最后采用乙腈洗脱AFM1，然后进行相关分析。

【产品组成】标准品（选配）；20支/盒，3mL柱管/支说明书1份；【所需材料】（不提供）（1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、高速均质器（18000r/min~22000 r/min）；量筒、50mL 玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸（whatman934-AH，直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。

（2）试剂：乙腈（色谱级）、蒸馏水或去离子水。

【样品制备及净化】----乳：将试样在水浴中加热至35℃~37℃。

用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。

至少收集20mL试样。

----乳粉：称取10g样品（精确至0.01g）,置于250mL 的烧杯中。

将50mL已预热到50℃的水加入乳粉中，搅拌溶解。

若乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴中放置至少30min，仔细混匀。

将溶解的乳粉冷却至20℃，移入100ml容量瓶中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。

用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。

免疫亲和柱的制备一、免疫亲和柱是什么呢？嘿呀，免疫亲和柱这个东西可有点小神奇呢。

它就像是一个超级精准的小卫士，专门用来捕捉特定的物质。

你可以把它想象成一个小小的陷阱，但是这个陷阱只对它要抓的“小坏蛋”感兴趣。

比如说，在检测一些食品中的有害物质的时候，免疫亲和柱就能大显身手啦。

它能够把那些微量的有害物质从复杂的样品中拽出来，就像从一堆沙子里挑出一颗特别的小石子一样厉害。

二、制备免疫亲和柱的材料准备要制作这个免疫亲和柱呀，材料可不能马虎。

首先得有合适的载体，这个载体就像是小卫士的家，得是那种既稳定又能让免疫物质好好附着的东西。

比如说琼脂糖凝胶，它就像是柔软又有粘性的小床，很适合免疫物质在上面休息呢。

然后呢，还需要抗体或者抗原，这可是关键的小卫士啦。

它们具有识别特定物质的超能力，就像小侦探的放大镜，能精准地找到目标。

而且呀，这些抗体或者抗原得是高质量的，不然这个小卫士可就不太靠谱啦。

另外，还需要一些化学试剂，像交联剂之类的，它们就像是小工匠手里的胶水，把抗体或者抗原牢牢地粘在载体上。

三、制备的具体步骤1. 载体的处理先把琼脂糖凝胶这种载体拿出来，要给它洗个小澡，把可能存在的杂质都去掉。

就像我们要把小卫士的家打扫得干干净净一样，这样抗体或者抗原住进去才舒服嘛。

然后呢，可能还需要对载体进行一些活化处理，让它变得更加活跃，就像给小床加上一些小弹簧，让它更有活力，这样就能更好地和抗体或者抗原结合啦。

2. 抗体或者抗原的结合把准备好的高质量抗体或者抗原和处理好的载体放在一起。

这个时候呀，就像小卫士找到了自己的家，它们会慢慢地结合在一起。

不过这个过程可不能着急，得给它们足够的时间，就像交朋友一样，需要慢慢相处才能建立起牢固的关系。

而且在这个过程中，要控制好温度和pH值这些条件，就像照顾小婴儿一样，要让它们处在最舒服的环境里。

3. 封闭未反应的位点在抗体或者抗原结合到载体上之后，载体上可能还会有一些空着的小位点，就像小房子里还有一些空房间一样。

免疫亲和柱原理
免疫亲和柱的原理是基于免疫学中的亲和力和柱色谱技术，用于分离和纯化特定蛋白质或生物分子。

免疫亲和柱通常由一个填充有特异性抗体的柱子组成。

当混合样品通过这个柱子时，抗体能够特异性与目标蛋白质结合，使目标蛋白质被牢固地捕获在柱子上。

其他非目标分子则可以通过柱子，被排除掉。

具体来说，以下是免疫亲和柱的工作原理：
1. 特异性抗体与目标蛋白质结合：免疫亲和柱的核心是特异性抗体，它能够高亲和力地结合特定的目标蛋白质。

这种结合是基于免疫学原理的，即抗体和抗原之间的相互作用。

2. 样品通过柱子：将待分离的蛋白质混合物通过免疫亲和柱。

当样品通过柱子时，特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物。

3. 洗涤去除非目标分子：通过洗涤步骤，将非目标分子从柱子中洗脱下来。

这样，只有目标蛋白质被保留在柱子上。

4. 目标蛋白质的洗脱：通过特定的洗脱条件，如改变pH 值、增加离子强度或者加入竞争性物质，使特异性抗体与目标蛋白质分离，从而将目标蛋白质从柱子上洗脱下来。

免疫亲和柱的优点包括高选择性和高亲和力，能够从复杂
的混合物中特异性地分离出目标蛋白质，因此广泛应用于蛋白质组学、生物医药、食品安全等领域中的分离、纯化和检测。

2015年药典黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法测定药材及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，流速0.8mL/min；采用柱后衍生法检测:光化学衍生法：光化学衍生器（254nm. PriboFast-KRC光化学柱后衍生器.Pribolab-MDU光化学柱后衍生器）；以荧光检测器检测，激发波长λex =360nm(或365nm)，发射波长λem =450nm。

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.0μg/m L、0.3μg/m L、1.0μg/m L、0.3μg/m L、）0.5mL，置10mL于量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

(Pribolab STD#1082-2 AFT混合标准品：AFT B1和AFT G1：1.0μg/mL，AFT B2和AFT G2：0.3μg/mL ）供试品溶液的制备：1. 取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入精密加入70%甲醇溶液75mL，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11,000r/min,®他物质萃取时间要求不一的需求，通过特殊结构设计实现在短时间内对真菌毒素等物质的高效粉碎、萃取，保证检测结果的准确性和精确度。

粉碎样品在不锈钢杯中通过电机旋转驱动刀同时进行劈裂、碾碎、掺合等过程。

使物料搅拌粉碎,转速高达22000以上,全金属机身和不锈钢杯子,抗有机溶剂的腐蚀,可以实现在2-3分钟高效实现真菌毒素的均质、萃取等关键环节。

优点：高速震荡3分钟即可完成整个真菌毒素及其他物质的萃取过程；●转速两档可调，低速12000r/min，高速22000r/min；●全金属机身，不锈钢材质，抗有机溶剂腐蚀；●可广泛应用于食品检验、科学研究、医学治疗、化工制药等行业；●本机构造方面均合于无菌操作的要求；●通过CE认证。

使用免疫亲和柱实验的体会一、引言免疫亲和柱是一种常用的实验技术，用于分离、富集和纯化特定靶标蛋白或抗体。

通过该实验，可以实现对目标蛋白的高度纯化，从而有助于进一步的研究和应用。

在本篇文章中，我将分享我在使用免疫亲和柱实验中的体会，包括实验原理、操作步骤、优缺点以及个人经验总结。

二、实验原理免疫亲和柱实验是基于免疫学原理的一种分离和纯化方法。

其原理主要包括以下几个方面：1.抗原-抗体反应：免疫亲和柱的基础是通过抗原-抗体反应来实现靶标蛋白的识别和分离。

抗原与抗体之间的亲和作用使得抗原能够被抗体结合，从而将目标物质与其他物质分离开。

2.亲和柱材料：亲和柱通常使用高度纯化的抗体作为固定相，将抗体固定在柱子内壁上。

常见的固定相材料包括蛋白A、蛋白G、蛋白L等。

3.样品处理：在实验开始之前，需要对待测样品进行预处理，如去除细胞碎片、脂质、核酸等杂质，保证实验结果的准确性和可靠性。

三、操作步骤免疫亲和柱实验通常包括以下几个步骤：1.背景杂质去除：将待测样品通过预清液柱（如PBS、甘氨酸缓冲液等）进行预清洗，去除背景杂质。

2.样品结合：将预清洗后的样品加入亲和柱中，使目标蛋白能够与固定相上的特异性抗体结合。

3.洗脱：通过洗脱缓冲液（如低pH或高盐浓度缓冲液）将非特异性结合物质洗脱，使得只有特异性结合的目标蛋白保留在亲和柱中。

4.后续处理：根据实验需要，可以选择进一步纯化目标蛋白或进行其他分析实验。

四、优缺点免疫亲和柱实验具有一系列优点，但也存在一些缺点，我们来一起看一下：优点：1.高度特异性：通过使用特异性抗体固定相，能够高选择性地结合目标蛋白，从而实现高度纯化。

2.高效性：免疫亲和柱能够在短时间内快速富集目标蛋白，有效提高样品的纯度。

3.适用性广泛：免疫亲和柱可以应用于多种样品类型，包括细胞提取物、血清、尿液等，适用于不同的研究领域。

缺点：1.成本较高：免疫亲和柱实验需要购买高价的特异性抗体和其他试剂，成本较高。

免疫亲和柱工作原理免疫亲和柱是一种基于抗体-抗原相互作用原理的生物技术工具，广泛应用于生物医学研究和生物分离纯化领域。

它可以高效地从复杂的混合物中富集目标分子，并实现其高纯度的纯化。

下面将详细介绍免疫亲和柱的工作原理。

免疫亲和柱的构成免疫亲和柱由一种固定化了抗体的固相材料组成。

这种固相材料通常是一种多孔的胶体状基质，如琼脂糖或琼脂糖微球。

抗体通过化学反应或物理吸附的方式固定在基质上，形成免疫亲和柱。

免疫亲和柱的工作原理当样品溶液通过免疫亲和柱时，目标分子会与固定在柱上的抗体发生特异性结合。

其他非特异性的杂质分子则会被洗脱出来，从而实现对目标分子的富集和纯化。

免疫亲和柱的工作过程可以分为以下几个步骤：1. 样品加载：将待富集的样品溶液加载到免疫亲和柱上。

样品中的目标分子与固定在柱上的抗体发生特异性结合。

2. 洗脱：为了去除非特异性的杂质分子，需要进行洗脱步骤。

洗脱缓冲液中的条件可以通过改变PH值、离子浓度或有机溶剂浓度来调节，从而使非特异性结合的分子失去结合能力，被洗脱出来。

3. 目标分子的洗脱：通过改变洗脱缓冲液的条件，使特异性结合的目标分子与抗体解离。

目标分子被洗脱到洗脱缓冲液中。

4. 纯化和收集：经过洗脱步骤后，目标分子已经被纯化。

可以将洗脱液收集起来，或者进一步进行后续实验分析。

免疫亲和柱的特点和应用免疫亲和柱具有以下几个特点：1. 高度特异性：由于固定在柱上的抗体具有高度特异性，能够特异性地结合目标分子，因此免疫亲和柱能够富集和纯化目标分子，同时去除非特异性的杂质分子。

2. 高选择性：通过选择适当的抗体，可以针对不同的目标分子进行富集和纯化，具有较高的选择性。

3. 简单易用：免疫亲和柱操作简单，无需复杂的设备和技术，适用于实验室规模的研究和分析。

免疫亲和柱在生物医学研究和生物分离纯化领域有着广泛的应用：1. 蛋白质纯化：免疫亲和柱可以用于富集和纯化特定蛋白质，用于进一步的功能研究或制备抗体。