免疫亲和色谱

免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素作者：孙艳杰赵磊李正刚王路宏来源：《中国民族民间医药·上半月》2023年第12期【摘要】目的：建立免疫親和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

方法：样品采用70％甲醇作为提取溶剂，经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生后，通过荧光检测器测定其中黄曲霉毒素的含量。

结果：黄曲霉毒素B1的线性范围为0.0104～0.0520 ng（r=0.999 9）、黄曲霉毒素B2的线性范围为0.0038～0.0190 ng（r=0.999 8）、黄曲霉毒素G1的线性范围为0.0108～0.0540 ng（r=0.999 8）、黄曲霉毒素G2的线性范围为0.0038～0.0190 ng（r=0.9998），线性关系良好，回收率在89.68%～101.44％之间，RSD≤3.5%。

结论：该方法操作简便，灵敏度高、重复性好、结果准确，可用于制马肾中黄曲霉毒素的测定。

【关键词】制马肾；免疫亲和柱；光化学衍生；高效液相色谱-荧光检测器；黄曲霉毒素【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2023）23-0019-04DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.23.zgmzmjyyzz202323005Simultaneous Determination of Content of Four Aflatoxins in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by Mmunoaffinity Column Clean-up and HPLC-FLD with Post-column Photochemical DerivatizationSUN Yanjie ZHAO Lei LI Zhenggang WANG Luhong*Siping Institute for Food and Drug Control，Siping 13600，ChinaAbstract：Objective To establish the contamination method of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by immunoaffinity column clean-up and HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization．Methods After extraction with 70% Methanol and purification by immunoaffinity columns，aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in samples were anlyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization.Results The linearity of Aflatoxin B1 was at 0.0104-0.0520 ng（r=0.9999）， Aflatoxin B2 was at 0.0038-0.0190 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G1 was at 0.0108-0.0540 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G2 was at 0.0038～0.0190 ng（r=0.9998）， The average recoveries were within 89.68%-101.44% wi th RSD≤3.5%. Conclusion The above method has demonstrated convenient operation，good repeatability，highsensitity and accuracy.This method is suitable for the determination of AF in Renshenguipi pills.Keywords：Equi Penis Et Testivulus；Immunoaffinity Column；Photochemical Derivation；HPLC-FLD；Aflatoxi马肾药材标准收载在《吉林省中药材标准》第二册2019版［1］，为马科动物成年马Equus caballus Linnaeus雄性的干燥阴茎及睾丸。

黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备及应用黄芪甲苷是黄芪中的一种有效成分，具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种药理作用。

为了更好地应用和研究黄芪甲苷，需要制备免疫亲和色谱介质来进行分离纯化。

本文将介绍黄芪甲苷免疫亲和色谱介质的制备过程和应用。

一、材料与方法1.材料（1）黄芪甲苷纯品；（2）碳酸钠、氯化钾、氯化钠、甲醛、硫酸丙酮、乙二胺四乙酸、聚乙二醇、N-羟基丁二酰亚胺、1-己烯基二甲氨基溴化铵、羧甲基纤维素钠；（3）羊驼抗黄芪甲苷单克隆抗体；（4）聚丙烯酰胺凝胶；（5）超纯水。

2.方法（1）制备黄芪甲苷荷载的聚丙烯酰胺凝胶① 准备聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺粉末按照说明书的比例溶解在超纯水中，制备出10%的聚丙烯酰胺凝胶溶液。

② 将聚丙烯酰胺凝胶离心去泡沫，加入羧甲基纤维素钠，用磁力搅拌器混合均匀。

③ 将凝胶溶液倒入色谱柱中，等待凝胶凝固。

④ 用1 M碳酸钠溶液冲洗凝胶，去除未反应的羧甲基纤维素钠。

⑤ 用0.1 M酸性缓冲液（pH 2.5）冲洗凝胶，调节pH值。

⑥ 用0.1 M氯化钠溶液反复洗涤凝胶。

⑦ 将黄芪甲苷和1-己烯基二甲氨基溴化铵混合，加入凝胶中，使黄芪甲苷荷载在凝胶上，保持室温反应16小时。

⑨ 用硫酸丙酮洗涤凝胶，将反应产物固定在凝胶中，再用0.1 M氯化钠溶液洗涤凝胶，去除未固定的胺试剂。

购买羊驼的全血，离心分离出血清。

将血清加入黄芪甲苷纯品，将得到的免疫反应产物经过多次纯化和稀释，得出含有单克隆抗体的血清。

将荷载了黄芪甲苷的聚丙烯酰胺凝胶切成小块，将其与含有单克隆抗体的羊驼血清经过反复混合，使黄芪甲苷分子与抗体结合，得到黄芪甲苷免疫亲和色谱介质。

二、应用将制备好的黄芪甲苷免疫亲和色谱介质填充在色谱柱中，可用于黄芪甲苷的分离纯化。

将黄芪提取液先通过预处理步骤，去除污染物，再加入色谱柱中，经过复杂的色谱过程，可取得高纯度的黄芪甲苷。

三、总结。

2008, Vol. 29, No. 12食品科学※分析检测552免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素Ａ的方法研究张辉珍２，马爱国１，＊，李惠颖２，王晓滨２（１．青岛大学医学院营养研究所，山东　青岛 ２６６０２１；２．青岛市产品质量监督检验所，山东　青岛 ２６６０６１）摘 要：试样经甲醇－水或碳酸氢钠－水溶液提取，提取液稀释过滤后经过含有赭曲霉毒Ａ特异性抗体的免疫亲和柱层析净化，洗脱液用Ｃ１８（１５０×４．６０ｍｍ，５μｍ）色谱柱分离，荧光检测器测定。

流动相为乙腈：水：乙酸为９９：９９：２；激发波长３３３ｎｍ；发射波长４７７ｎｍ；柱温３５℃；进样量１００μｌ；外标法定量，结果表明，色谱峰面积与含量之间有良好的线性关系，方法的检出限为０．２μｇ／ｋｇ，加标回收率为９０．３％～１０６％，对不同浓度的样品相对标准偏差ＲＳＤ为１．７５％～４．３２％。

该方法操作简便、准确，回收率高、精密度良好、重现性好，可用于谷物、酒类、调味料等产品中赭曲霉毒素Ａ的测定。

关键词：赭曲霉毒素Ａ；免疫亲和层析净化；高效液相色谱Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａ　ｉｎ　Ｆｏｏｄｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｇｈ　ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＺＨＡＮＧ　Ｈｕｉ－ｚｈｅｎ２，ＭＡ　Ａｉ－ｇｕｏ１，＊，ＬＩ　Ｈｕｉ－ｙｉｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｂｉｎ２（１．Ｉｎｓｔｉｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０２１，　Ｃｈｉｎａ；２．Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｑｕａｌｉｔｙ，　Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０６１，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａ　（ＯＴＡ）　ｉｎ　ｆｏｏｄｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．　Ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈａｎｏｌ－　ｗａｔｅｒ　ｏｒ　ＮａＨＣＯ３ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．　Ａｆｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｔａｒｃｔｓ，　ｆｌｏｗｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ＯｃｈｒａＴｅｓｔ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ＯＴＡ．　Ｔｈｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｗａｓ　ｅｌｕｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ，　ＯＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ，　ｐｕｒｅ　ｗａｔｅｒ，　ａｎｄ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｉｎ　ｔｕｒｎ．　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌｅｌｕａｔｅ　ｗａｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｏｎ　Ｃ１８　（１５０×４．６０　ｍｍ，５μｍ）　ａｔ　３５　℃　ｗｉｔｈ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－　ｗａｔｅｒ－　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　（９９：９９：２，　Ｖ／Ｖ）　ａｓ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅａｔ　ｔｈｅ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ ０．９０　ｍｌ／ｍｉｎ．　Ｔｈｅ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　３３３　ｎｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ　４７７　ｎｍ．　Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆＯＴＡ　ａｒｅ　９０．３％　ｔｏ　１０６％，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ　ａｒｅ１．７５％　ｔｏ　４．３２％　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｆｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅ．　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，　ｒａｐｉｄ，　ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＯＴＡ　ｉｎ　ｆｏｏｄｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａ；ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｌｅａｎ－ｕｐ；ＨＰＬＣ中图分类号：ＴＳ２０７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０５５２－０３收稿日期：２００７－１０－１９作者简介：张辉珍（１９６６－），女，高级工程师，博士研究生，研究方向为营养与食品安全。

Instructions 71-7086-00 AF Affinity mediaGE Healthcare CNBr-activated Sepharose™ 4B CNBr-activated Sepharose 4B is a pre-activated medium for immobilization of ligands containing primary amines. It provides a very convenient way to immobilize ligands by the cyanogen bromide method. The coupling reaction is spontaneous, rapid and easy to carry out. The application area covers immobilization of proteins, peptides and nucleic acids.通用电气医疗集团CNBr-activated琼脂糖™4 b CNBr-activated琼脂糖4 b是固定地激活介质的包含一级胺配体。

它提供了一个非常方便的方法固定溴化氰配体的方法。

偶联反应是自发的,快速和容易执行。

应用领域涵盖固定的蛋白质、多肽和核酸。

Table 1. Medium characteristics.Bead structure: 4% agaroseSpacer: NoneCoupling capacity: 25–60 m g α-chymotrypsinogen/ml drained medium Bead size range: 45–165 μmAverage bead size: 90 μmMax linear flow rate*: 75 cm/h at 25°C, HR 16/10 column, 5 cm bed heightpH stability**:表1。