关于激光共聚焦显微镜拍照后图像的处理

激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。

本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。

一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。

二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。

三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。

四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。

五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。

激光共聚焦操作步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM），是一种光学显微镜，利用激光和扫描镜技术，能够对样品进行高分辨、高对比度的三维成像。

下面将介绍激光共聚焦显微镜的操作步骤。

1.准备工作：a.打开显微镜电源，确保仪器处于正常工作状态。

b.打开激光源电源，等待激光系统启动。

c.准备样品，将样品放置在载玻片上，并使用封口膜或密封胶固定。

2.调节孔径光阑：a.打开镜头盖，取下玻璃保护盖。

b.观察显微镜视野，调节孔径光阑的大小，以获得最佳的入射光。

c.用合适的滤光片选择适当激光激发波长。

3.调节激光功率：a.打开激光源的控制面板。

b.选择合适的激光功率，通常初次使用时可选择较低功率。

c.通过目镜观察激光处于合适的位置和方向，避免直接观察激光。

4.调节焦距：a.打开目镜盖，观察样品上的图像。

b.调节目镜的焦距，获得清晰的图像。

c.使用恰当的倍率进行观察，确保所需的细节可见。

5.调节光路：a.打开激光共聚焦显微镜软件，进行光路调节。

b.调节反射镜和聚焦镜，确保激光能够准确地聚焦在样品上。

c.通过调节扫描镜，使激光能够扫描整个样品。

6.设置扫描参数：a.在软件中选择扫描参数，如扫描速度、像素大小等。

b.减至最小的扫描区域，以便首先观察最感兴趣的区域。

c.如有需要，可以进行连续扫描或者多通道扫描的设置。

7.开始扫描：a.点击软件界面上的“开始”按钮，开始扫描。

b.观察扫描时光点在样品上的移动情况，确保图像的获取和处理是正确的。

c.根据需要调整扫描参数，以获得更好的图像质量。

8.界定感兴趣区域（ROI）：a.选择感兴趣的图像区域，用鼠标进行界定。

b.设置参数，如增益、对比度、亮度等，以便获得更好的视觉效果。

c.按下截图按钮，将感兴趣的图像保存下来。

9.分析和处理图像：a.关闭扫描功能，进入图像处理模式。

b.使用软件提供的功能分析和处理图像，如三维重建、图像拼接等。

激光扫描共聚焦显微镜使用说明标签：激光扫描共聚焦显微镜使用说明激光扫描共聚焦显微镜可以：（1）光切片扫描、3D图像处理、时间序列拍摄成像；（2）细胞、绿荧光蛋白、生物荧光样品观察分析；（3）荧光原位杂交分析。

详细实验方法共聚焦显微镜激光扫描法实验方法原理激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。

调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

实验材料细胞试剂、试剂盒荧光染料水培养基仪器、耗材激光扫描共聚焦显微镜载玻片洗瓶滴管试管实验步骤一、观察及仪器操作1. 开启仪器电源及光源一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。

以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。

使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。

2. 设置相应的扫描方式在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。

切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。

3. 获取图像选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。

4. 关闭仪器仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。

若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。

二、获取三维图像激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。

激光共聚焦显微镜用法
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是一种高分辨率的显微镜，其能够通过激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。

以下是激光共聚焦显微镜的使用方法：
1. 样品制备：将样品制备好，并固定在载玻片或载片上，以便于放入显微镜中观察。

2. 调整显微镜：将载玻片或载片放入显微镜中，调整激光聚焦点的位置和大小，以便于观察样品的细节。

3. 设置参数：根据样品的性质和需要观察的结构，设置激光功率、扫描速度、探测器增益等参数，以获得最佳的成像效果。

4. 开始扫描：启动激光扫描仪，将激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。

5. 分析数据：通过软件对获得的图像进行处理和分析，以获得更详细的信息和结构。

6. 结果展示：将处理后的图像进行展示和分析，以便于研究人员对样品进行更深入的了解和研究。

总之，激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜，其能够帮助研究人员观察和研究样品的细节和结构，为生物医学研究和材料科学研究提供了强有力的工具。

激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。

在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。

一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。

本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。

请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。

2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。

在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。

二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。

2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。

3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。

三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。

2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。

根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。

3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。

4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。

5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。

6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。

7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。

激光扫描共聚焦显微镜ZEISS 780操作规程本设备属于精密设备，操作人员必须提前熟悉其适用范围、结构、性能及其具体操作方法，未经操作培训者不能进行上机操作。

通过操作培训的人员必须严格按照仪器管理老师的培训要求及设备使用说明书指定的操作进行工作。

1.开机提前进行镜检，确保样本无误；查看空调温度、抽湿机湿度和不间断电源工作情况。

1.1开三相稳压电源。

注意：先开稳压电源后面的黑色扳手开关①，再按下稳压电源前面的绿色按钮②，如果出现报警声，请马上关闭稳压电源，并报告管理人员。

1.2两分钟以后依次打开电源控制板上的三个开关。

先打开主开关MAIN SWITCH③，再依次打开SYSTEMS/PC④和COMPONENTS⑤开关。

注意：各个开关不要同时按下，开机时仪器会进行自检，每按下一个开关，请等待相应的部件自检完毕后再开下一个开关。

1.3打开电脑开关⑨，点击“LSM User”图标，进入桌面；当看到桌面右下角显示“注意安全”图标时，方可点击桌面中央的ZE N软件图标；然后点击“Start System”按钮开启软件。

注意：当桌面右下角始终不显示“注意安全”图标时，不可启动软件。

这时把电脑主机左边那台仪器的盖子掀开，按一下“Reset”按钮，等待电脑桌面右下角出现“注意安全”图标。

1.4打开氩离子激光器（若不使用458nm或488nm或514nm激光线则不需要打开）。

先打开氩离子激光器正面的开关ON⑥，再顺时针旋转钥匙⑦至“—”的方向，等待绿色指示灯亮起方可开启光路(大约5-10min)。

注意：Ar+激光器在启动后，需要1h左右的预热时间才能进入稳定状态。

若闲置时间1h以上，可将激光器扳钮由“laser run”位置扳至“idle power”处⑧，保护激光器，延长使用寿命。

2.找目标2.1在明场下用Transmitted light找目标，点击①、②、③、④注意：如果实验只使用空气镜，放置样品后，建议先选择低倍物镜找细胞，再换用高倍物镜微调即可。

激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。

*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。

前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。

基于激光扫描共聚焦显微镜的相关图像处理技术研究一、本文概述Overview of this article随着科学技术的快速发展，激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM）作为一种高分辨率、高灵敏度的光学成像技术，在生物医学、材料科学等领域的应用日益广泛。

然而，激光扫描共聚焦显微镜产生的图像数据量庞大，且包含丰富的信息，如何有效地处理和分析这些图像，提取出有用的信息，是当前亟待解决的问题。

With the rapid development of science and technology, Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM), as a high-resolution and highly sensitive optical imaging technology, is increasingly widely used in fields such as biomedical and materials science. However, the image data generated by laser scanning confocal microscopy is massive and contains rich information. How to effectively process and analyze these images to extract useful information is an urgent problem that needs to be solved.本文旨在探讨基于激光扫描共聚焦显微镜的相关图像处理技术，分析这些技术的原理、特点以及应用现状，并在此基础上提出一种有效的图像处理方法。

该方法旨在提高图像质量，减少噪声干扰，增强图像中的有用信息，从而便于后续的图像分析和解释。

激光扫描共聚焦显微镜的综述基本原理由于生物研究中免疫荧光技术的应用越来越广泛，研究人员发现，当实验室所用的荧光标本稍厚时，该显微照片的分辨率较低，由于传统显微镜技术都使用的是场光源，由于标本层次的重叠结构区别（内部细胞结构）就会产生衍射和散射光的干扰，使标本中的多处细胞结构的成像模糊和发散。

激光共聚焦显微镜的首先主要是利用激光扫描形成的点光源，加上共聚焦原理，在荧光标记标本的焦平面上各个点的处理,光信号穿透探针小孔到达光电倍增管，再经过信号数字图像处理观察、分析和输出，在计算机监视屏上形成图像。

其特点是可以对样品进行断层成像，非侵入的观察三维空间结构。

由于光栅针孔和探针孔对物镜是共轭对称的，焦平面同时聚焦于光栅针孔和探测针孔。

进行点扫描时，逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。

与聚焦光点相应的光源针孔和观察针孔必须对准，故称共聚焦。

这样，大大提高了系统信噪比和成像清晰度。

这种技术对于观察厚的样品显得尤为重要。

传统的免疫荧光显微镜在厚的样品中只能看到表面发出的荧光，LSCM可以深入到样品内部，具体到某一个层面。

20多年来，虽然共聚焦显微镜的扫描方式使得扫描共聚焦显微镜在生物医学领域有了广阔的用武之地。

包括以下几个方面：⑴多波长激光器产生更明亮的点光源。

⑵噪声很低光学检测器⑶效率很高的反射镜。

⑷图像处理大大加快了。

⑸视频显示技术分辨率大大提高。

⑹亮度更大、更稳定的荧光探针激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用1 定量荧光测定LSCM 通过计数接收到的光子，进行多次重复的荧光定量分析，和活细胞定量分析。

LSCM通过这些方法来对单细胞或细胞群的各种细胞器，结构蛋白，核酸，酶和受体分子等特异性结构的含量与分布进行定量分析，同时还可测定膜电位，氧化还原状态等生化反应变化程度。

此外，我们可以用LSCM来完成对细胞内的荧光强度、细胞周长及细胞内颗粒数等参数进行测定。

我们还可以LSCM 可用于细胞骨架装配、细胞凋亡机制、离子通道的装配等多个方面的研究。

浙江大学硕士学位论文基于激光扫描共聚焦显微镜的相关图像处理技术研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：郑筱祥;张恒义20060501图１－２激光扫描共聚焦显微镜系统原理图激光扫描共聚焦显微镜成像系统的光学原理图如图卜２所示。

从激光光源系统发出的激光，经过显微镜的透镜系统，穿过针孔，在透镜的焦平面上形成一个聚焦光点。

针孔的作用是滤除来自透镜的杂散光和散焦光。

聚焦的光点经过另一个透镜系统，穿过分光镜，再经过显微镜的物镜系统，在物镜的焦平面上形成一个聚焦光点。

分光镜的作用相当于一个光开关，把不同的光转换到不同的光路上。

这个聚焦光点落在物镜焦平面上的样本上，产生反射光和发射光。

这个反射光和发射光就是样本在该点的光学图像。

发射光是样本在受到照射激光的激发下，吸收了激发光的能量，发生能级跃迁而发出的光。

一般情况下，发射光的波长和激发光的波长是不相同的。

反射光和发射光穿过物镜到达分光镜。

分光镜只把发射光反射到显微镜的聚光镜头。

发射光经过聚光镜头，穿过针孔，在聚光镜头的焦平面上形成一个聚焦光点。

针孔的作用是滤除从物镜焦平面上方和焦平面下方的样本的发射光。

聚焦的光点落在位于聚光镜焦平面上的光检测器的光敏面上，形成样本的光学图像【６Ｊ【７删Ｉ射。

１．３激光扫描共聚焦显微镜的特点和应用１．３．１激光扫描共聚焦显微镜的特点激光扫描共焦显微成像系统的优点：３．４实验结果与分析３．４．１图像获取对经过染色后的样本，在共聚焦显微镜＿Ｆ，经过三维层切就得到对应的ＬＳＣＭ数据场，图３－６是在Ｆｌｕａｒ２０ｘ／Ｏ．７５ｕＶ干燥系物镜下以０．５２ｘ０．５２×１．ＯＯｒｔｍ分辨率对用ＣａｌｃｉｕｍＯｒａｎｇｅ标记Ｃａ２＋的神经细胞做层切（针孔孔径为２００Ｂｍ）得到的断层图像。

图３—７是在ＦｌｕａｒｌＯＯｘ／１．３Ｏｉ１ＵＶ油浸系物镜下以０．０７ｘＯ．０７ｘ１．ＯＯｒｔｍ分辨率对用Ｆｌｕｅ３标记Ｎ０的神经元细胞做层切（针孔孔径为２００１Ｊ＿ｍ）得到的断层图像。

激光共焦扫描显微镜中的图像复原方法
黄琳;陶纯堪;胡茂海
【期刊名称】《光子学报》
【年(卷),期】2007(36)4
【摘要】在非负值和有限支撑域的递归逆滤波(NAS-RIF)盲图像复原算法的基础上,根据激光共焦扫描显微镜(LCSM)采集到的图像特点,提出了改进方法.首先对LCSM 采集到的显微图像进行高斯滤波以提高退化图像的信噪比,然后进行局部直方图均衡以突出显微图像的细节,最后在代价函数中加入空间自适应正则化项,较好地恢复了具有丰富细节信息的显微图像.
【总页数】3页(P642-644)
【关键词】激光共焦扫描显微镜;图像复原;NAS-RIF算法
【作者】黄琳;陶纯堪;胡茂海
【作者单位】南京理工大学电光学院
【正文语种】中文
【中图分类】TN911.73
【相关文献】
1.激光共焦扫描显微镜中断层图像的混合增强处理 [J], 黄琳;陶纯堪
2.激光共焦扫描显微镜中基于体绘制技术的三维重构 [J], 黄琳;陶纯堪;胡茂海
3.激光共焦扫描显微镜中一种新的三维重构算法 [J], 黄琳;陶纯堪;高万荣;胡茂海;杨晓春
4.EPP通信在光纤激光共焦扫描显微镜中的应用 [J], 刘步荣;迟泽英;赵琦
5.体绘制技术在激光共焦扫描显微镜中的应用 [J], 黄琳;陶纯堪;胡茂海
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