奶牛孕酮酶联免疫检测试剂盒的研制

牛孕酮(P)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中孕酮(P)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛孕酮(P)水平。

用纯化的牛孕酮(P)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入孕酮(P)，再与HRP标记的孕酮(P)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的孕酮(P)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛孕酮(P)浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800pmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液20ml×1瓶20ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

奶牛乳汁孕酮免疫检测方法研究进展核心提示：摘要：有关乳汁孕酮的放射免疫检测技术和酶联免疫检测技术，近几十年来不断有报道，并逐渐成熟。

但是测试费用、技术人员培养及方法本身的弊端等因素，使得这些项技术的普及受到了限制。

这就要求从业人员不断创新，摘要：有关乳汁孕酮的放射免疫检测技术和酶联免疫检测技术，近几十年来不断有报道，并逐渐成熟。

但是测试费用、技术人员培养及方法本身的弊端等因素，使得这些项技术的普及受到了限制。

这就要求从业人员不断创新，开发更有市场价值、老百姓更易接受的测试方法。

胶体金试纸条在医学上应用广泛，已经呈现出了它应用于动物医学中，在激素测定方面乐观的应用前景。

关键词：孕酮；放射免疫技术，酶免疫技术，胶体金免疫技术孕酮(P4)是奶牛和黄牛在发情周期(一般为21 d)中由卵巢的黄体产生的一种激素，可以进入血液、乳汁和唾液中。

它的浓度在发情期中最低，到发情周期的中期因黄体成熟而达到最高水平[1]。

如动物未配种或配而未孕，则在发情周期的最后2 d～3 d内黄体会退化而孕酮浓度下降至基础水平。

如母牛已受孕，则黄体将继续保持，不再发情，孕酮浓度将在整个妊娠期维持较高水平。

因此，在母牛配种后21 d～24 d期间采奶测定孕酮浓度的高低，可以判断该牛是否受孕[2]。

由于发情期间奶中孕酮浓度最低，这种方法也可判断奶牛是否处于发情期。

临床上，孕酮测定被主要用于确定排卵、孕激素治疗监测和早期妊娠状态的评价。

通过孕酮检测，区分出已孕奶牛、休情期奶牛或发情周期不规律的奶牛，以便迅速采取适当的措施。

奶牛早期妊娠诊断技术的研究，对缩短产犊间隔和减少输精次数，减少经济损失，具有明显的经济意义。

目前在妊娠诊断方面应用最多的是乳样和血样中孕酮的测定，且有国外资料表明，奶孕酮含量几乎接近血孕酮含量，这就避免了采血影响奶牛产奶量的问题，受到人们普遍欢迎。

近年来，在激素测定方面，孕酮的免疫测定研究最多，实用性也最强，如放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(IA，包括ELISA，LAIT，HEIA等)，胶体金检测方法等。

专利名称：现场快速诊断奶牛早孕与发情用的酶免疫分析测试盒
专利类型：发明专利
发明人：郭大智
申请号：CN02113263.1
申请日：20020123
公开号：CN1361424A
公开日：
20020731
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及的是可在现场快速诊断奶牛早孕与发情用的酶免疫分析测试盒,包括固相载体和检测用试剂两部分。

检测试剂中有以抗孕酮抗体为第一抗体,还包括有抗第一抗体的第二抗体。

检测试剂的组成为:使用前以磷酸盐缓冲液溶解的酶标孕酮,以磷酸盐缓冲液配制的孕酮标准品,使用前以磷酸盐缓冲液稀释的抗孕酮抗体,使用前以碳酸盐缓冲液稀释的抗第一抗体的第二抗体,过氧化氢和含有四甲基联苯胺缓冲液的第一和第二显色剂,pH7－7.4的磷酸盐缓冲液和pH9－9.8的碳酸盐缓冲液。

用本发明测试盒可以在现场由奶牛的奶样品快速准确地判断奶牛是否已受孕或发情的分析检测结果。

申请人：郭大智
地址：625014 四川省雅安市雨城区四川农业大学101研究室
国籍：CN
代理机构：成都立信专利事务所有限公司
代理人：濮家蔚
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牛孕酮 (progestogen)酶联免疫分析试剂盒使用说明书产品编号：E0459b注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。

操作步骤实验开始前，请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

每次检测都应该做标准曲线。

如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液100ul（在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。

终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

在加终止液后立即进行检测。

奶牛孕酮酶联免疫检测试剂盒的研制庞观龙;何达崇;温和心【摘要】为了掌握母牛孕酮水平变化信息,为发情鉴定、妊娠鉴别和卵巢疾病诊断提供参考依据,根据ELISA基本原理,研制了奶牛孕酮ELISA检测试剂盒.结果表明,采用孕酮一牛血清白蛋白(P4-BSA)交联物解决了在酶标板上包被抗原的问题,且抗原容易保存;而利用孕酮-卵清白蛋白(P4-OVA)交联物免疫兔子获得高效价抗体,能阻断1 ng/mL孕酮水平;并以ELISA棋盘测定法确定P4-BSA 2000倍、血清500倍稀释为该试剂盒最佳工作浓度.该试剂盒以牛粪作为检测样品,即通过粪便中的孕酮水平变化可为奶牛发情鉴定、妊娠鉴别、繁殖障碍性疾病诊断提供可靠的技术支撑.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2010(041)004【总页数】4页(P386-389)【关键词】奶牛;孕酮;酶联免疫吸附测定法;抗体效价【作者】庞观龙;何达崇;温和心【作者单位】广西农业职业技术学院,南宁,530007;广西科学院生物研究所,南宁,530003;广西科学院生物研究所,南宁,530003【正文语种】中文【中图分类】S854.4+3雌性动物性周期中孕酮水平呈规律性变化，发情期孕酮水平最低，黄体期孕酮水平较高，妊娠期孕酮水平则一直维持在较高水平上，即孕酮水平与发情周期、妊娠等高度相关。

在雌性动物血液、乳汁及粪便中均含有微量的孕酮，一般化学方法无法检测。

传统的孕酮检测方法是采用放射免疫方法（RIA）［1］，该方法具有较高灵敏度，但测定费时、所需设备特殊、价格昂贵，且放射物处理不好还会污染环境，因此，不适宜在生产中推广使用。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，利用抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的信号放大作用检测大分子抗原或抗体，因其具有快速、灵敏、简便等优点，目前已被广泛应用于多种细菌、病毒疾病的诊断［2～5］。

奶牛乳汁孕酮免疫检测的方法
张国岩
【期刊名称】《养殖技术顾问》
【年(卷),期】2012(000)007
【摘要】孕酮（P4）是奶牛和黄牛在发情周期（一般为21天）中由卵巢黄体中产生的激素,可以进入血液、乳汁和唾液中。

在母牛配种后21～24天期间采集奶测定孕酮浓度,可以判断牛是否受孕。

发情期间奶中孕酮浓度可判断奶牛是否处于发情期。

临床上,孕酮测定被主要用于确定排卵、孕激素治疗监测和早期妊娠状态的评价。

通过孕酮检测，区分出已孕奶牛、休情期奶牛或发情周期不规律的奶牛，以便迅速采取适当的措施。

对缩短产犊间隔和减少输精次数，减少经济损失，具有明显的经济意义。

【总页数】1页(P165-165)
【作者】张国岩
【作者单位】黑龙江省铁路兽医卫生处,163000
【正文语种】中文
【中图分类】S858.23
【相关文献】
1.放射免疫分析法比较奶牛粪便和乳汁中的孕酮含量 [J], 王旻子
2.奶牛孕酮酶联免疫检测试剂盒的研制 [J], 庞观龙;何达崇;温和心
3.奶牛乳汁孕酮免疫检测方法研究进展 [J], 冯晓群;张乃生;杨正涛;冯晓声;周晓菲;
蔺俐仲
4.奶牛乳汁孕酮免疫检测方法研究进展 [J], 冯晓群;张乃生;杨正涛;冯晓声;周晓菲;蔺俐仲
5.奶牛乳汁中孕酮的浓度值与受胎率之间关系的研究 [J], 晋鹏;乌志平
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孕酮ELISA试剂盒在牛奶乳汁检测中的初步应用吴凌;高维明;张洪友;徐闯;李兰【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2015(51)21【摘要】本实验利用自建的奶牛乳汁孕酮竞争ELISA法(酶标抗原法)研发了奶牛乳汁孕酮ELISA试剂盒.通过对试剂盒的特异性、灵敏性、重复性、稳定性和回收率等主要性能进行优化试验.结果表明:试剂盒可以在4℃条件下保存9个月,与睾酮、雌三醇、雌二醇无特异性反应,灵敏度为0.14 ng/mL,批内差异为4.11％,批间差异为6.26％,回收率为93.80％～107.60％,变异系数为5.65％.应用该试剂盒检测乳汁孕酮诊断奶牛妊娠与未妊娠的准确率分别为93.3％和95.8％.因此,该试剂盒性能良好,妊娠诊断效果理想,为今后在奶牛生产中的广泛应用奠定基础.【总页数】5页(P54-58)【作者】吴凌;高维明;张洪友;徐闯;李兰【作者单位】黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319【正文语种】中文【中图分类】S823.4【相关文献】1.狂犬病毒ELISA抗体检测试剂盒的初步应用 [J], 张德宝;朱秀同;刘涛;李艳莉;柳珊;何平有;郁宏伟;梁武2.牛奶中孕酮直接竞争ELISA检测方法的建立 [J], 高维明;张洪友;夏成;李徐延;徐闯3.日本乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 [J], 李建;谢红玲;廖园园;秦红刚;刘洁;朱薇;漆世华;韩兴;徐松;舒银辉4.猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 [J], 廖园园;李建;秦伟;朱薇;曹娟;漆世华;谢红玲;温文生5.副猪嗜血杆菌Apd-ELISA抗体检测试剂盒的制备和初步应用 [J], 田杨;刘云宝;马辉;潘其聪;肖静;陈焕春;蔡旭旺;徐晓娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。