酶联免疫使用试剂盒检测过程中值得关注的问题

酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。

常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。

操作规程：溶液配制1、针对呋喃唑酮、呋喃它酮、氯霉素等试剂盒，他们的1X洗液、1X样品稀释液、终止液是通用的。

检测数量大的情况下可以大量配制洗液、样品稀释液等，一般建议一个礼拜重配一次。

2、可以或需要前处理前配制的溶液：呋喃类：缓冲溶液、样品稀释液、1M HCL、1M NaOH、10mM邻硝基苯甲醛、洗涤工作液氯霉素：样品稀释液、洗涤工作液3、检测时配制的溶液：呋喃类：A、B液需在洗板前配制好，并混合均匀。

氯霉素：酶结合物工作液、A B液样本处理呋喃类：1、1g组织样本+4ml水+0.5ml 1M HCL+400ul 10nM邻硝基苯甲醛，剧烈涡动1min；2、60℃温箱孵育1h，然后拿出来涡动30s，继续孵育0.5h；3、依次加入5ml缓冲溶液、400ul 1M NaOH、6ml乙酸乙酯；4、剧烈涡动1min后4000g离心10min；5、取3ml上清液50-60℃氮气吹干，加入2ml正己烷，再加入1ml样品稀释液，高速涡动30s；6、4000g以上，离心5min，去上层及中间层杂质，取下层液体待测。

氯霉素：1、3g样品+ 6 mL 乙酸乙酯，充分涡动1 min后4000 g 离心 10 min；2、取 4 mL 上层乙酸乙酯50-60℃氮气吹干，加入2 mL正己烷，充分涡动10 s，再加入 1 mL 样品稀释液，低速涡动 1 min；3、4000 g 以上，离心 5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50 µL 进行检测。

检测过程呋喃唑酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶标二抗+50ul抗体工作液后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。

呋喃它酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶结合物后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。

ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。

这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。

一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。

试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。

2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。

3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。

温育时间不足，温度过低都会影响显色。

4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。

5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。

6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。

二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。

1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。

2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。

3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。

重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。

酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项作者：任小龑来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。

ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。

关键词：酶联免疫;吸附试验;满版实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。

原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。

影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。

只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。

一、移液枪的使用我院免疫实验室常用手动单道移液器。

注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。

吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。

移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。

不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。

ELISA试剂盒常见注意事项LISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。

因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。

6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。

◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。

◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。

◎特异性：常用交叉反应率表示。

含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。

◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。

◎准确度：通过添加回收实验进行评价。

◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。

◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。

◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。

◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。

3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。

酶联免疫吸附实验常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。

标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。

单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。

Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。

对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。

目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。

因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。

移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

掌握移液器的正确使用和维护。

关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。

尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。

通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。

酶联免疫试剂盒实验操作注意事项
1. 检测试剂盒在使用前，需在室温下进行复温。

本试剂盒加样后室温反应时间为10分钟，环境温度对检测结果会有很大的影响，所以控制好环境温度（国际标准室温是20-25℃）是试剂盒检测性能发挥所必须的条件。

另外，所有反应过程需保持在水平位置，禁止倾斜放置。

2.样品提取尽量采用离心取上清的方法，对样品的稀释可以有效降低基质干扰，但稀释一定是要保证整个反应在同一体系下反应，对AFB1样品来说，甲醇的含量须始终保持与标准品一致（35%）。

3. 加样过程做重复孔是使检测结果更真实的接近于实际值，在确保加样精度的前提下，避免孔与孔之见的污染，每孔必须更换枪头，酶标板微孔中避免出现气泡，如不慎有气泡用干净枪头戳破，加样时确保用枪方法的一致性，减少非系统误差。

4. 洗板过程很重要，有条件建议使用洗板机，如人工洗板，则在加入洗液过程中，每孔中的液体尽量不要溢出到邻近板孔，如果洗板效果不好很容易造成本底偏高。

5. 加样过程一定要迅速准确，尽量保持每孔反应时间的均一性和加样顺序的前后一致性，如果样本超过20个，请用排枪做，避免造成前后反应时间不一致而导致的结果偏差。

6. 数据分析和处理，建议使用专门软件，根据具体情况选择合适的拟合方式，对AFB1试剂盒来说，建议使用CS曲线进行分析。

7.AFB1具有见光分解的特性，样品提取加样等过程请注意避光。

临床ELISA检测的常见问题与对策就目前的情况来说，酶联免疫吸附法（ELISA）作为一种十分常用的感染性标志物的检测手段，其测定结果的准确性及可靠性将直接影响临床诊断及治疗的效果，在临床实际操作的过程中，经常会因为仪器、试剂、工作人员操作等方面地原因影响到酶联免疫吸附法（ELISA）的测定结果。

为了进一步提高ELISA 的测定结果，本文主要对临床ELISA的检测常见的问题进行分析，并提出了针对其相关原因采取的措施。

标签：ELISA测定；问题分析；对策措施前言ELISA测定的主要原理是利用抗原、抗体之间的特异反应通过某种或者是几种酶来连接测物，经过底物及酶的相互作用，将改变溶液的颜色，进而通过观察溶液的颜色，来判定测定的结果。

在医院检验科，ELISA是作为常用的，也是最为重要的一种感染性标志物的检测方法，本文主要对ELISA在临床测定实践中存在的常见问题及其发生原因进行分析。

一、临床ELISA检测的主要问题在进行临床ELISA测定过程中，常常会碰到整板显色、白板、无法检测出弱阳性质控样本以及测定重复性较差等问题。

1、整板显色主要表现在没有彻底清洁洗板，污染了洗液，进而导致显色液毁坏、变质，或者是加反酶结合物，通常这种问题主要存在于HBsAb、HBsAg 测定中。

2、白板主要是指整板无色，也将阳性对照包括在内，比如像洗液中存在酶抑制剂，酶结合物漏加，显色剂漏加A或B。

或者是将终止剂当做显色剂用。

3、无法检测出弱阳性质控样本。

比如显色时间不足，不能准确判定样本测定结果；或者是水浴温度没有达标，水育时间不足等。

4、测定重复性较差。

具体指标本处理方法不对，没有正确设置酶标仪，混合应用不同批号的试剂组，微板孔条受到污染，显色时间、洗板时间、水育时间不一，样本加错，样本量添加不准确。

二、临床ELISA试剂盒的选择及使用1、按照临床实际检测项目选择ELISA试剂盒从试剂盒的生产厂家宣传材料及说明书中，能够大概了解不同厂家试剂盒的地相同点及不同点，例如：固相材料的来源，包破抗体或者是抗原的性质、检测模式、色原底物、检测时间等，按照实验室的条件做出初步的选择意向。

酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。

在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。

本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。

二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。

在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。

2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。

通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。

此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。

3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。

在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。

三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。

对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。

此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。

2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。

稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。

四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。

在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。

（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。

（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。

2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。

ELISA试剂盒检测过程中的注意事项ELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。

下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。

一、ELISA实验通用规则1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。

可用水和电子天平进行确定。

但最好有专业人员进行矫正。

2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。

吸取不同的液体后，要更换枪头。

即使是吸取标准品时。

3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

4、实验时，要使底物避光保存。

5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。

也可以用酶标仪的晃动功能。

9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。

10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。

没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。

11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。

加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。

12、底物是光敏感的，要在临用前现配。

13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。

14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。

15、待检样品要澄清，否则会影响结果。

16、温浴时间应遵守试剂盒规定。

17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶标记物。

２００９ ＮＯ．３２ＣＨＩＮＡ　ＦＯＲＥＩＧＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ药物与临床ＥＬＩＳＡ是２０世纪７０年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，但影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。

现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下。

１ 试剂的因素要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，严格按照说明书进行操作。

注意在ＥＬＩＳＡ测定中将试剂盒在室温下放置２０～３０ｍｉｎ后再进行测定，如从冰箱中拿出来即用可造成弱阳性标本的检测出现假阴性。

　２ 样本的因素 ２．１ 内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等［１］可与固相上包被的特异抗体ＩｇＧ以及随后加入的酶标的特异抗体ＩｇＧ结合，从而出现假阳性结果。

２．２ 外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

２．２．１ 标本溶血 血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）为标志的ＥＬＩＳＡ测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的ＨＲＰ底物反应显色，故严防标本溶血。

２．２．２ 标本的保存 标本污染可使实验出现非特异性显色。

反复冻融在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。

因此，ＥＬＩＳＡ检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，５ｄ之内应４℃保存，长时冻存的样本避免反复融冻［２］。

２．２．３ 标本凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。

解决的方法有：将采集后的血液放入３７℃水浴中１ｈ，待充分凝固后再离心分离血清［３］。

３ 操作中的因素 ３．１ 加样孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。

小鼠C-jun酶联免疫分析ELISA试剂盒注意事项1．人C-jun试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

小鼠C-jun酶联免疫分析ELISA试剂盒实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠C-jun水平。

用纯化的小鼠C-jun抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-jun，再与HRP标记的C-jun抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的C-jun呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠C-jun浓度。

4-溴-2,6-二氟苯酚CAS号：104197-13-9 进口、组装1-溴-2-甲基丁烷CAS号：10422-35-2 进口、组装苯基琥珀酸CAS号：10424-29-0 进口、组装4-十二烷基苯胺C AS号：104-42-7 进口、组装4-氯甲基吡啶CAS号：10445-91-7 进口、组装肉桂醛CAS号：104-55-2 进口、组装N-苄基乙醇胺CAS号：104-63-2 进口、组装2-氧代环戊烷羧酸甲酯CAS号：10472-24-9 进口、组装3-二乙胺基丙胺C AS号：104-78-9 进口、组装2-氟-5-羟基苯甲腈CAS号：104798-53-0 进口、组装4-甲基氯苄CAS号：104-82-5 进口、组装2-氨基-3-碘吡啶CAS号：104830-06-0 进口、组装对甲苯甲醚CAS号：104-93-8 进口、组装3-环戊基丙酰氯C AS号：104-97-2 进口、组装5,6,7,8-四氢喹啉CAS号：10500-57-9 进口、组装2-溴-5-甲氧基吡啶CAS号：105170-27-2 进口、组装四丁基醋酸铵CAS号：10534-59-5 进口、组装2-甲氧基-4-吡啶甲酸CAS号：105596-63-2 进口、组装小鼠C-jun酶联免疫分析ELISA试剂盒。

由于ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。

虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。

如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。

尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。

现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。

1 标本及采集、贮运因素严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。

一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。

超过一周测定的需－20℃保存。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

浅谈ELISA检测中的注意事项及常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的原理是：捌抗原或抗体包被到固相载体表面。

将受检样品和酶标抗原或抗体，按一定程序与已包被的抗原或抗体反应，形成抗原抗体复合物，加入酶反应底物后，底物被酶催化成有色产物，最后通过定性或定量的分析有色产物的量，即可确定样品中被测物质的含量。

ELISA法由于测定灵敏、特异，操作简便，且无放射性污染等优点，已成为目前应有最广的一种免疫测定技术。

在基层医院主要用于乙肝抗原抗体及HIV抗体的检测。

现将ELISA操作中的注意事项及常见问题讨论如下：1 注意事项1.1仪器设备：①实验室设备应定期维护校准，酶标仪、水温箱、加样枪，应每年校准一次。

②每日查看并登记冰箱的温度。

③洗板机的管路用纯净水冲洗，以防堵塞和腐蚀。

1.2试剂准备：①检查试剂的注册证、包装、效期。

②从冷藏环境取出的试剂盒应平衡至室温后方可使用。

微孔③板打开包装后应立即将未使用的板条装入有干燥机的自封袋中密封，置2-8℃避光保存，尽快使用。

④洗涤液若出现絮状沉淀应立即更换。

⑤试剂使用前应摇匀。

⑥不同批号的试剂不可混用。

⑦所用的蒸馏水应有质量保证。

1.3标本的采集及保存①溶血标本因血清中含有过氧化物酶易造成假阳性。

未②完全凝固的血液标本应含有纤维蛋白原易造成假阳性。

③被微生物污染的标本可造成假阳性。

④待测标本不可使用NaN3防腐可造成假阴性。

⑤标本在2-8℃保存，若长期保存应置-20℃保存并避免标本反复冻融1.4加样需①有经验操作人员进行操作。

②加样枪吸样及排放速度要均匀一致，不能过快。

③每加一份样本须更换吸头，一管血检测多个项目时，应先做ELISA测定，避免交叉污染。

④加样后应充分混匀。

1.5孵育：常用的孵育温度是37℃，温育时间和温度严格按说明书操作。

1.6洗板虽不是反应过程，但却是决定实验成败很关键的一步。

洗①板机洗板设置合理的工作程序，板孔加液量不宜过多或过少。

②手工洗板：弃去孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置30-40秒，甩干，重复5次排干，拍板纸不能重复使用，应注意个人防护。