牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证

牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒验证试验
牛结节性皮肤病（bovine nodular dermatitis，BND），也称为“木眼病”，是一种
由病毒引起的牛皮肤病。

这种病毒属于大痘病毒(Orthopoxvirus)属，是一种DNA病毒。

在病发地区，BND对牛业造成了很大的损失。

一种用于检测病毒存在的方法是酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。

ELISA是一种定量分析技术，主要用于检测、诊断、研究和监测各种病原体的存在和反应。

ELISA技术已广泛应用于病原体和相关蛋白的检测中，因其灵敏度高、
稳定性好、操作简便和费用低等方面的优点而受到越来越多的关注。

为了验证牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒的灵敏度和特异性，进行了一系列的实验。

首先，用经过纯化的BND病毒蛋白质对测试剂盒进行评估。

评估结果表明，该测试剂盒具
有很高的灵敏度和特异性，可以准确地检测到BND病毒蛋白质的存在。

其次，采集30头罹患木眼病的牛的血清样品，以及30头健康牛的血清样品，并使用BNS ELISA测试剂盒进行检测。

结果显示，在30头罹患木眼病的牛中，有29头（97%）血清样品检测出BND病毒蛋白质。

而在30头健康牛中，所有血清样品均未检测出BND病毒蛋白质，这表明该测试剂盒具有很高的特异性。

综上所述，本研究验证了牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒的灵敏度和特异性。

在日
常的病原体检测中，该测试剂盒可以起到重要的作用，有利于疾病的快速及时发现和治疗，从而降低生产成本，提高养殖效益。

牛血清白蛋白的提取与鉴定一、实验目的1. 掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法2.掌握盐析法、透析法及电泳法二、实验原理牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。

等电点4.8。

应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。

再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。

三、操作步骤（一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。

（二）透析（1 ）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂（2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+(3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。

(4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。

(5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

（三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。

标准液点一次，待测液点三次。

（2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。

牛血清蛋白含量实验报告实验名称：牛血清蛋白含量实验实验目的：1. 测定牛血清中蛋白质的含量。

2. 掌握蛋白质含量测定方法的原理与操作技巧。

实验原理：本实验以伯胺蓝法测定牛血清中蛋白质含量。

伯胺蓝是一种与蛋白质结合的染料，可以通过测定染料与蛋白质的吸光度来确定蛋白质的含量。

实验步骤：1. 预备试样：取少量牛血清样品，加入5倍体积的生理盐水稀释，得到稀释液。

2. 制备标准曲线：取一系列不同浓度的标准蛋白溶液，如0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL，分别取0.2mL放入不同试管中，加入1.8mL伯胺蓝试剂，室温下反应30分钟后，用紫外分光光度计在595nm处测量吸光度，得到吸光度-浓度曲线。

3. 测定样品吸光度：将稀释液使用相同的方法反应30分钟后，同样在595nm 处测量吸光度。

4. 计算蛋白质含量：利用标准曲线上的吸光度值和已知浓度进行插值计算，得出样品中蛋白质的浓度。

实验数据与结果分析：本次实验测得的标准曲线如下：浓度(mg/mL) 吸光度0.1 0.150.2 0.310.3 0.470.4 0.630.5 0.79利用标准曲线的插值计算，得出牛血清样品中蛋白质的浓度为0.35 mg/mL。

讨论与结论：通过本实验的测定，我们成功地测量出了牛血清样品中蛋白质的含量为0.35 mg/mL。

该结果可以作为参考值，用于评估牛血清中蛋白质的含量。

实验中可能存在的误差源及对策：1. 稀释液的配制：如果在稀释液的配制中出现误差，将会导致测定结果的不准确。

因此，在配制稀释液时应严格按照实验要求进行操作，并确保各步骤的准确性。

2. 吸光度的测量：在用紫外分光光度计测量吸光度时，仪器的误差或者使用不恰当的操作方式，都可能导致结果的误差。

因此，在测量吸光度时，要仔细调节光度计的工作状态，并注意操作规范。

改进措施和建议：1. 精确控制稀释液的配制比例，减小误差。

2. 测量吸光度时，遵循操作规范，确保测量结果的准确性。

一、实验目的1. 掌握牛血清蛋白提取的基本原理和方法。

2. 学习双缩脲试剂法测定牛血清蛋白含量的原理和操作。

3. 了解牛血清蛋白在生物医学研究中的重要性。

二、实验原理牛血清蛋白（BSA）是一种重要的生物大分子，广泛用于生物化学、分子生物学和免疫学等领域。

本实验采用双缩脲试剂法测定牛血清蛋白含量，其原理是：蛋白质分子中含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），在碱性条件下能与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

生成的紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内具有良好的线性关系。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 牛血清- 双缩脲试剂：硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾- 6.0mol/L NaOH 溶液- 0.1mol/L HCl 溶液- 比色皿- 移液器- 紫外可见分光光度计2. 实验仪器：- 电子天平- 磁力搅拌器- 酶标仪四、实验步骤1. 牛血清蛋白提取：（1）取一定量的牛血清，用0.1mol/L HCl溶液调节pH值至4.7；（2）加入等体积的丙酮，充分混合，静置过夜；（3）离心，取上清液，即为牛血清蛋白溶液。

2. 牛血清蛋白含量测定：（1）取一定量的牛血清蛋白溶液，用0.1mol/L HCl溶液调节pH值至4.7；（2）加入适量的双缩脲试剂，混匀；（3）将溶液置于酶标仪中，在540nm波长处测定吸光度；（4）根据标准曲线计算牛血清蛋白含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：（1）分别取不同浓度的牛血清蛋白标准溶液，用0.1mol/L HCl溶液调节pH值至4.7；（2）加入适量的双缩脲试剂，混匀；（3）将溶液置于酶标仪中，在540nm波长处测定吸光度；（4）以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 牛血清蛋白含量测定：（1）根据标准曲线，计算牛血清蛋白溶液的浓度；（2）根据实验测定的牛血清蛋白溶液浓度，计算牛血清蛋白含量。

六、实验讨论1. 本实验采用双缩脲试剂法测定牛血清蛋白含量，操作简便、快速、准确。

牛血清白蛋白的提取与鉴定自主设计实验实验目的：本实验的目的是通过自主设计实验，探究牛血清中白蛋白的提取和鉴定方法。

实验原理：牛血清中的白蛋白是一种重要的血浆蛋白，提取牛血清白蛋白一般采用碳酸铵沉淀法。

实验步骤：1.首先，将牛血液收集到干净的离心管中，然后离心10分钟，以分离血浆和红细胞。

2.将分离得到的血浆转移至一个新的离心管中，并加入2mL的碳酸铵溶液，充分混合。

3.将混合液在4℃下孵育30分钟，然后在3000g下离心20分钟。

4.倒掉上清液，得到沉淀。

5.使用0.9%的氯化钠溶液将沉淀洗涤3次，每次离心10分钟。

6.吸去上清液，将沉淀溶解在适量的生理盐水中，得到白蛋白溶液。

鉴定牛血清白蛋白的方法有很多，这里我们以SDS-电泳为例进行鉴定：1. 准备1.5mm厚度的10%分离凝胶和4%集中凝胶。

2.将提取得到的牛血清白蛋白样品和已知浓度的蛋白标准品分别加入适量的2×样品缓冲液，进行蛋白样品的变性处理。

将样品在100℃水浴中加热10分钟。

3. 将蛋白样品和蛋白标准品以及预染色标记的蛋白质分子量标记物（Marker）加载到凝胶孔中，并进行电泳。

4.样品电泳结束后，将凝胶转移到显色/脱色缓冲液中，进行凝胶染色。

5.在染色后，观察凝胶中蛋白质的迁移情况，并用相应的软件或图像分析系统进行分析。

根据分子量标记物的迁移位置，可以确定牛血清白蛋白的迁移位置，并据此进行鉴定。

实验注意事项：1.实验操作货真价实，遵守实验室安全规定，注意个人防护。

2.实验过程中要注意消毒操作，避免细菌的污染。

3.实验设备及试剂用前要检查是否完好，避免实验过程中的故障。

4.实验室操作要注意卫生，实验后要做好清洁工作。

实验结果分析：根据实验结果，我们可以通过SDS-电泳方法成功提取并鉴定牛血清白蛋白，并确定其迁移位置。

根据其迁移位置可以进一步研究牛血清白蛋白的性质和功能。

实验改进及扩展：1.可以尝试不同的提取方法，如层析法、电泳法等，比较不同方法的效果。

附录VIII F 牛血清白蛋白残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定供试品中牛血清白蛋白（BSA）含量量，以判断供试品中BSA残残留量是否符合规定的检测方法。

以牛血清白蛋白标准品为标准，采用直线回归方法计算供试品中牛血清白蛋白含量。

供试品溶液的制备供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后震荡混匀，室温静置30分钟，检测前应再次震荡混匀。

供试品如为液体剂型可直接用于检测。

采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行两个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。

测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。

干扰试验制备溶液A（供试品溶液倍比稀释）、B（供试品溶液和30ng/ml 的内控标准品等量混合）和C（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。

其中，供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，两倍稀释后制备溶液A和B。

溶液A、B可倍比稀释测定，溶液C应多孔测定，并在试验间均匀添加。

测定法按试剂盒说明书进行。

试剂盒标准品的吸光度值（A值）、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度值（A值）均应在试剂盒要求范围内，试验有效。

以试剂盒提供的标准品吸光度值（A值）和浓度制定标准曲线，根据供试品的A值计算供试品中BSA含量，按试剂盒说明书要求判定最终结果。

供试品测定时，低稀释度A值明显低于高稀释度A值时可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。

首次应用该试剂盒的供试品应进行干扰试验。

干扰试验中B－A值应在C值测定的95％可信区间内。

免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。

抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。

关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。

红色表示十位数,用黄色表示个位数。

免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。

小鼠腹腔注射以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推?0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。