色谱基础知识

紫外可见光检测器对环境温度、流速、流动相组成等的变化不敏感，可用于梯度洗脱，具有选 择性好、灵敏度高、噪声低等优点，再高效液相色谱中应用最广，几乎所有的液相色谱仪都配 备有紫外可见光检测器。部分仪器厂家还配备了双波长检测器。
紫外检测器使用前需要预热，待基线稳定后再进样，流通池与管路漏液或堵塞时应及时处理。 使用时应关闭检测器前面板，紫外检测器流通池耐压指标为12MPa（12μL），是所有液相检测 器中最高。，两台检测器串联使用时应先经过紫外检测器再串联其他检测器。氘灯的保证使用 时间是2000小时，使用时不要频繁开关，如果2000小时内氘灯故障可以联系厂家更换。如果使 用时间超过2000小时，氘灯能量正常还可以继剂效应：溶剂效应（solvent effect）亦 称“溶剂化作用”。指液相反应中，溶剂 的物理和化学性质影响反应平衡和反应速 度的效应。溶剂化本质主要是静电作用。 对中性溶质分子而言，共价键的异裂将引 起电荷的分离，故增加溶剂的极性，对溶 质影响较大，能降低过渡态的能量，结果 使反应的活化能减低，反应速度大幅度加 快。
荧光检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性，比紫外检测器的灵敏度高两个数量级，特别适 用于痕量分析，在环境检测、药物分析、生化分析中有着广泛的用途。多环芳烃、霉菌毒素、 卟啉、儿茶酚氨等都可用荧光检测器检测。对于某些本身不发荧光的物质，如氨基酸、脂肪酸 可利用化学衍生技术使其生成荧光衍生物再进行检测。荧光检测器对温度、流量变化不敏感， 可以使用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱相关知识
色谱柱通常安装再柱温箱内起到恒温恒压提高柱效延长柱寿命的目的，安装柱子时需要注意流 动相的方向，下进上出以排除气泡，根据分析的目的选择合适的色谱柱。
高效液相色谱柱相关知识
反相模式是第一选择，其中又以C18柱最为常见，反相离子对色谱和正向色谱是第二选择。 色谱柱连接时应避免产生死体积，常用的色谱连接头是peek接头，连接peek接头时如果peek接 头管线伸出的长度不够将产生缝隙，这就是柱外死体积；如果死体积产生再进样器出口处，上样体 积将增加，样品将展宽。如果死体积产生再色谱柱出口，本来分离的样品又混合了，一同进入检测 器，样品分离度将下降。死体积严重时甚至可能会导致漏液、色谱峰形劣化、重复性差。
荧光检测器由激发光源、激发光栅、样品池、发射光栅和光电倍增管等组成。激发光源多采用 氙灯或激光，单色器采用光栅，能进行光谱的自动扫描。光源发出的连续光谱，经激发光栅分 光后选择特定波长的单色光作为激发光进入样品池，样品受激发后发出荧光，荧光向四面发射， 为避免激发光的干扰，取与激发光成直角方向的荧光进行检测，荧光至发射光栅分光后，单一 波长的发射光由光电倍增管接收转换成电信号进行检测。
色谱法特点：分离性好、灵敏度高（10-9~10-12g）、选择性高（同分 异构体、旋光异构）、分析速度快、进样量小（1~100μL）、多组分 同时分析、易于自动化。
高效液相色谱仪器组成
仪器组成：硬件+软件（工作站）
流动相
检测器
柱温箱及 色谱柱
输液泵 高效液相色谱仪硬件组成
进样器
简易流程图：
流动相在输液泵的推动作用下源源不断地输 送到泵后系统，经过进样器携带一定量样品，然 后进入色谱柱，色谱柱通常安装在柱温箱内，起 到恒温恒压、提高柱效、延长色谱柱柱寿命、保 证试验数据的重复性。样品在色谱柱中根据待分 析组分在固定相和流动相中分配系数不同从而分 离，依次流出色谱柱到达检测器。检测器将光信 号转换为电信号，工作站上即输出色谱图。
高效液相色谱仪器分类
HPLC根据保留机理不同可以分为以下几种类型：
● 反相色谱 （reversed phase chromatography）：固定相为非极性键合相，即基质硅胶键合的 是非极性的烃基硅烷，烷基配合基可以是不同链长的正构烷基或苯基，如C8、C18（简称ODS， 应用最多）、苯基柱等。流动相为极性溶剂，常以纯水为基础溶剂再加入一些有机调节剂如甲 醇、乙腈、四氢呋喃等。组分与固定相的作用力是疏水性作用力，组分的烷基长链或芳香基与 ODS色谱柱的C18键合相之间具有疏水性作用力，作用力越大组分的保留就越强。流动相极性 大于固定相极性，组分的极性越强出峰时间越快（相似相溶原理），所以反相色谱图中流动相 中水的比例越高出峰时间越晚，保留时间越长。此模式为液相色谱分析第一选择。 ● 离子对色谱 （ion-pair chromatography）：样品离子与流动相的反离子生成疏水性离子对， 而为反相色谱固定相保留，反相离子对色谱法采用疏水性的苯乙烯或二乙烯基苯树脂键合的硅 胶作为固定相，流动相是含有离子对试剂和有机溶剂如甲醇或乙腈的缓冲水溶液。分为阴离子 化合物（氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵），阳离子化合物（烷基磺酸钠类）。离子对疏水性 增强组分的保留性增强。增大离子对的浓度有利于疏水性离子对的形成，组分的保留随之增大。 此法还可以同时分离离子性和非离子性的混合物。
高效液相色谱检测器相关知识
可变波长紫外可见光检测器光路
岛津紫外可见光检测器光路
高效液相色谱检测器相关知识
●二极管阵列检测器（PDA）：可以得到吸光度、波长、时间的三维色谱图。使用光电二极管阵列 作为检测单元，阵列由数百到上千，如211、512、1024个光电二极管组成。每个二极管测量一窄波 段的光谱，由于扫描速度非常快，可在10ms内完成一次检测，远远超过色谱流出峰的速度，因此不 用停泵。
高效液相色谱法适用范围
高效液相色谱（HPLC）是以液体为流动相，适合于分析沸点 较高，300摄氏度以上热稳定性较差的大分子化合物，液相色谱通 常是选定色谱柱后通过改变流动相的种类及组成以及操作参数， 如柱温、流动相梯度等来优化分离。液相色谱的流动相除了具有 运载样品分子的作用，其条件不同，如调节不同pH值、不同极性 、不同缓冲体系对分离结果均有影响。
色谱柱的存放：色谱柱不用时，应按照使用说明书中指定的存储溶剂充分冲洗，从仪器内取下 并上堵头放入色谱盒中储存。
柱温：再高效液相色谱分析中，柱温一般为室温或接近室温，但适当提高柱温可以改善传质、 提高柱效。
高效液相色谱柱相关知识
●塔板理论：运用热力学观点，把色谱柱设想成有许多塔板构成的分馏塔，样品组分在塔 板间移动，在每块塔板中样品组分在流动相和固定相之间达到分配平衡。随着流动相的流 动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一根色谱柱的塔 板数越多，其分离效果越好。塔板理论中提出了理论塔板数n和理论塔板高度H的概念， H=L/n，L为色谱柱长。
●紫外可见光检测器（UV）：一种选择性浓度型检测器，其工作原理基于朗伯-比尔定律，即被测 组分对紫外光或可见光的吸收强度与组分浓度成正比（A=ECL），很多有机分子都具有紫外（10380nm）或可见光（380-780nm）吸收基团，因此紫外可见光有很广泛的应用领域。
可变波长紫外可见光检测器，相当于装有流通池的紫外可见光分光光度计，某些型号仪器配备 双光源，紫外区用氘灯，可见区用钨灯。入射光分别通过样品池和参比池，使用光电二极管检 测将光信号转变为电信号。
二极管阵列检测器与紫外检测器的使用注意事项是基本相同的。
高效液相色谱检测器相关知识
岛津二极管阵列检测器光路
高效液相色谱检测器相关知识
●荧光检测器（RF）：是一种灵敏度和选择性极高的检测器，某些具有特殊结构的化合物，受紫外 光激发后，能发射出另一种较长波长的光，称为荧光。波长较短的紫外光称为激发光，产生的荧光 称为发射光。当被测样品的浓度足够低且其他条件一定时，荧光强度正比与荧光物质的浓度，依此 可进行定量分析
高效液相色谱法适用范围
● 正相色谱 （normal phase chromatography）：固定相为极性键合相，即基质硅胶表面键合极 性有机基团，如氰基、氨基（分析糖）、二醇基（分析蛋白质）等，流动相为非极性或弱极性 的有机溶剂。此模式组分与固定相之间的作用力为氢键力，例如由于苯环上大∏键的作用苯环 与硅胶柱的氢键力最弱，最早出峰，苯酚的氢键力最强，最晚出峰，三代苯酚由于酚羟基邻位 有两个取代基削弱了酚羟基的氢键力出峰时间介于苯酚与苯之间。即极性弱的化合物先出峰， 极性强的化合物后出峰（相似相溶原理）。正相模式下主要试剂是正构烷烃（戊烷、己烷、庚 烷），若流动相极性太低不能润湿固定相极性表面或对样品溶解不好，可加入适量的中等极性 的有机溶剂如氯仿、醇类、乙醚等。随着流动相里有机相的比例提高组分出峰时间提前。此模 式与反相色谱互补，适用于不溶于水或有机混合液的亲脂性样品。 ● 离子交换色谱 （ion exchange chromatography）：以离子交换树脂作为固定相，流动相是缓 冲水溶液或者有机溶剂与缓冲水溶液的混合液。依据组分离子与固定相的离子交换能力的差异 而分离，组分离子与离子基亲和力愈大愈容易交换到固定相上，其保留时间愈长反之愈短。阴 离子分析常用碳酸、硼酸等碱性缓冲液，阳离子分析常用硝酸、硫酸等酸性缓冲液。固定相根 据离子基所带电荷不同分为阳离子交换剂(-)和阴离子交换剂(+)。此模式适用于无机和有机阴阳 离子分析。 ● 尺寸排阻色谱 （GPC/GFC）：利用表面惰性具有一定孔径分布的多孔凝胶的独特特性作为 固定相，利用分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。根据流动相类型不同可以分为以 有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱（GPC）和以水溶液为流动相的凝胶过滤色谱（GCF）， GPC主要用于分析聚合物，常用流动相是四氢呋喃、氯仿等，GFC主要用于生命科学领域。适 用于分离分子质量大的化合物。分子大的化合物先洗脱出来。不能用来分析复杂多组分样品。
为了观察方便通常将三维图转换成二维图，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标称为色谱图。以 波长为横坐标，习惯都为纵坐标称为光谱图。
二极管阵列检测器可以提供关于色谱分离、定性定量的丰富信息，发现单波长检测时未检测到 的峰，通过比较一个峰中不同位置的吸收光谱，计算峰纯度，建立光谱库，进行谱库搜索，光 谱定性。
色谱基础知识
曾序行 2020.3.15
色谱原理
1.色谱起源