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PCR检测转基因大豆：[目的]定性检测转基因大豆。
[方法]以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为检测的目的片段,建立PCR反应体系。
采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立：采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异的引物和探针,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。
该方法的检测灵敏度<001%,是国际上设定的转基因最低限量的100倍用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品：用从转基因大豆(Glycinemax )颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。
结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10-14g/μL的溶液。
用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeepinggene)。
ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究：以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。
此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。
转基因食品的检测方法自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。
但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。
许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。
我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。
世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。
因此转基因产品的检测就显得尤为重要。
转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。
本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。
1核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。
椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。
核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
1．1定性检测1．1．1聚合酶链式反应(PCR)1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。
利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。
Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。
生命科学前沿讲座论文转基因食品的检测方法姓名：陈继款系别：生命科学学院专业：生物信息学年级：2008级学号：080567011指导老师：薛李春总成绩：2010年07月02日转基因食品的检测方法自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。
但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。
许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。
我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。
世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。
因此转基因产品的检测就显得尤为重要。
转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。
本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。
1核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。
椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。
核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
1．1定性检测1．1．1聚合酶链式反应(PCR)1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。
利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。
转基因大豆摘要：本文主要研究转基因大豆，主要包含转基因大豆的抗药性原理，转基因大豆存在的隐患及危害，转基因大豆的检测，转基因大豆的生产现状与趋势关键词：转基因大豆转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。
1996年春，美国伊利诺伊西部许多农场主种植了一种大豆新品种——转基因大豆，这种大豆是移植了矮牵牛的一种基因，这个新大豆品种可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）而草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。
原理：转基因大豆的研制是为了配合草甘膦除草剂的使用。
除草剂有选择性的和非选择性的，草甘膦是一种非选择性的除草剂，可以杀灭多种植物，包括作物，这样，虽然这种除草剂的效果很好，但是却难以投入使用。
草甘膦杀死植物的原理在于破坏植物叶绿体或者质体中的EPSPS合成酶。
通过转基因的方法，让植物产生更多的EPSPS 酶，就能抵抗甘草膦，从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。
转基因大豆油对人体危害：1、转基因大豆及产品会引起跨物种感染，使人类感染动物的疾病，带来严重灾难。
转基因食品中引入特定的基因或病毒，为跨物种感染埋下了通道。
转基因食品引起跨物种感染的破坏性非常严重，不得不加倍慎重对待。
2、转基因大豆及其产品会损害人体的内部系统。
转基因大豆的组成物质与非转基因大豆相比有较大的变化，如植物凝血素提高了约1倍，蛋白酶抑制剂高26．7％，而蛋白质和苯丙氨酸明显下降，维生素B2复合体胆碱的含量低29％等，这些组成物质的变化可能会使人体生长缓慢，使人身材矮小；转基因大豆还含有一种类似雌性激素钓化学物质，它会破坏人体荷尔蒙，导致人体生殖器官异常，并损害免疫系统。
此外，有证据表明，转基因大豆食品与非霍奇淋巴瘤发病率的提高具有一定相关性。
3、转基因大豆及其产品可能对人体产生过敏反应。
全世界有近2％的成年人和4％—6％的儿童发生过食品过敏，而90％的过敏是由蛋、鱼、贝壳、奶、花生、大豆、坚果和小麦8种食物引起的。
大豆转基因检测标准1. 背景介绍大豆是世界上最重要的农作物之一，它不仅是一种重要的食物来源，还被广泛用于饲料和工业原料。
然而，随着转基因技术的发展，转基因大豆的种植和使用逐渐增多。
转基因大豆不仅在农业上具有重要意义，还引发了广泛的争议。
因此，制定一套严格的大豆转基因检测标准对于保障食品安全和消费者权益至关重要。
2. 转基因技术概述转基因技术是指通过人工手段将外源基因导入到目标生物体中，并使之在目标生物体中表达。
在大豆中引入外源基因可以使其具有抗虫、抗草甘膦等特性。
然而，转基因技术也引发了人们对食品安全和环境影响等问题的担忧。
3. 国际转基因检测标准为了保证食品安全和国际贸易畅通，国际上制定了一系列关于转基因检测的标准。
其中最为知名且被广泛采用的是国际贸易法组织（Codex Alimentarius Commission）制定的转基因食品检测指南。
该指南包括了转基因检测的样品准备、检测方法、结果解释等方面的要求，为各国制定转基因食品标签要求提供了依据。
4. 国内大豆转基因检测标准现状在国内，大豆转基因检测标准的制定和执行也取得了一定进展。
2002年，中国农业部发布了《农业转基因生物安全管理办法》，其中包括了对农产品生产和加工中使用的转基因生物的监管要求。
此外，中国质量认证中心还发布了《农产品质量安全监督管理规范》，其中涉及到对大豆及其加工产品中转基因成分的监管。
5. 大豆转基因检测方法为了准确、可靠地检测大豆中是否存在转基因成分，科研人员开发出多种不同的检测方法。
目前常用的方法包括PCR法、ELISA法和质谱法等。
PCR法是一种通过扩增目标DNA片段来判断是否存在特定外源DNA 序列的方法；ELISA法是一种通过特异性抗体与外源蛋白质结合来判断是否存在特定外源蛋白质的方法；质谱法则是通过检测样品中特定外源蛋白质的氨基酸序列来判断是否存在转基因成分。
6. 大豆转基因检测标准的制定制定一套严格的大豆转基因检测标准对于确保食品安全和保护消费者权益至关重要。
PCR技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
近年来，PCR技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。
本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术上的支持。
关键词：荧光定量PCR RT-PCR 探针引物（一）PCR技术简介及其运用概述聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。
聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。
聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
1、PCR技术原理双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
2、PCR工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA 聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月目录前言........................................................................3. 实验一大豆样品的准备 (4)实验二大豆DNA的提取和纯化 (4)实验三靶标基因的扩增 (6)实验四反应产品检测 (10)实验五结果分析 (12)参考文献 (12)前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。
普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通PCR。
因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
*基金项目：国家“十五”“863”项目（2001AA212291）资助。
黄昆仑：1968年生，博士研究生，E-mail ：<hkl009@>.**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail ：<yunbol@>.收稿日期：2003-01-01接受日期:2003-04-16农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(5):461~466·研究论文·用巢式和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品*黄昆仑罗云波**（中国农业大学食品学院,北京100083）摘要：用从转基因大豆()颗粒中提取的DNA 作为模板，经过稀释，形成不同浓度梯度的DNA 溶液，然后用巢式和半巢式PCR 进行扩增反应。
结果表明，巢式和半巢式PCR 均可以扩增DNA 浓度为10-14g/μL 的溶液。
用巢式和半巢式PCR 对市场的食品原料和深加工食品进行检测，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因（housekeeping gene ）。
其中，2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S-基因片段，说明这些食品中含有转基因大豆成分，占被检测食品的76.5%。
用巢式PCR 和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready 和其深加工食品是一种有效的方法。
关键词：转基因大豆Roundup Ready ；食品；（半）巢式PCR ；检测Detecting Genetically Modified Soybean Roundup Ready Ingredient in Foodstuffsby Nested PCR and Semi-nested PCRHuang Kunlun Luo Yunbo**（Food Science College,China Agricultural University,Beijing 100083,China）DNA was extracted from GM soybean()Roundup Ready kernels and diluted a series of solutions ，and thenused for templates and amplified by nested PCR and semi-nested PCR.The result showed that the template concentration of 10-14g/μL DNA solution could amplified by nested PCR and semi-nested PCR.Different kinds of soybean foodstuffs from supermarketwere detected by nested PCR and semi-nested PCR ，the results showed that soybean housekeeping gene could be amplifiedfrom 10kinds of foodstuffs （17kinds of brands food ），including soybean oil ，sauce ，lecithin ，bean curd ，soybean milk ，soyhean milketc.8kinds of foodstuffs （14kinds of brands food ）could be amplified segment of CaMV35S-，which indicated these foods weremade by soybean Roundup Ready ingredient.Therefore,nested PCR and semi-nested PCR are the effective methods for detecting GMsoybeanfoodstuffs.genetically modified soybean Roundup Ready;food;nested PCR and semi-nested PCR;detection对转基因生物及其加工食品的检测，目前在国际上比较认同的是利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR ）对转基因食品成分的遗传背景进行检测[1~6]。
由于许多食品在加工过程中DNA 受到了较大的破坏，可供利用的DNA 模板数量有限，容易造成由于DNA 模板数量太低不能得到足够PCR 产物而出现假阴性的结果[7]。
同时，由于加工食品的成分比较复杂，对DNA 模板质量会产生较大的影响，造成了检测结果假阴性概率的增加。
因此，研究利用适当的DNA 提取方法和PCR 检测方法显得尤为重要。
巢式PCR （nested PCR ）是在普通PCR 基础上发展起来的一种PCR 技术，在分子生物学研究和医学检测方面研究较多[8~11]。
其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR 反应对某个基因进行检测。
通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经农业生物技术学报2003年过20~30次循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。
半巢式PCR（semi-nested PCR）的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有一对半引物，有一个引物被用于二次PCR 反应中。
这两种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。
因此，可以应用于对转基因食品进行PCR检测。
本研究将巢式和半巢式PCR技术应用于对转基因大豆Roundup Ready及其加工食品的定性检测，以解决由于食品的深加工对DNA分子造成的严重破坏以及在DNA提取过程中DNA损失较多，而造成的普通PCR方法难于检测和提高假阴性率的弊病，探索一种可以有效定性检测食品中是否含有转基因大豆Roundup Ready成分的方法，为我国的定性检测转基因食品提供相应的技术平台。
1材料和方法1.1材料转基因大豆()Roundup Ready为中国农业科学院品种资源研究所馈赠，大豆食品或含大豆成分食品为超市购买。
1.2DNA的提取采用本实验室的LH-Smart DNA提取试剂盒。
大豆颗粒先用1%的升汞溶液消毒，用无菌水清洗干净后，再用无菌水浸泡24h。
将一粒大豆放入1.5 mL的离心管中，用灭菌的新玻璃棒拈碎，加入1.2 mL的LHⅠ溶液。
固体或粉状食品用研钵研碎食品，称取150mg放入1.5mL的离心管中，加入1.2 mL的LHⅠ溶液。
大豆油取10mL、大豆磷脂2g加入30mL正己烷溶解，再加入1.0mL的LHⅠ溶液，振荡30s后，在2300离心30s，以促进分层，吸取下层水相600μL放入1.5mL的离心管中。
豆腐、面酱等取300mg放入1.5mL的离心管中，加入1.2mL的LHⅠ溶液。
酱油等溶液状食品适当加热蒸发部分水分后，取300mL放入1.5mL的离心管中加入1.2mL的LHⅠ溶液。
将上述处理过的样品在75℃水浴中保温30 min，常温下12300离心3min，取上清液600μL，加入1.5倍的LHⅡ溶液，在冰浴上放置15min 后，在4℃下12300离心10min。
弃上清液，加入1mL70%的预冷乙醇，剧烈振荡20s后，常温下12300离心2min，弃上清液。
加入65℃预热的Wash Buffer溶液700μL，剧烈振荡1min后，常温下12300离心3min。
取上清液600μL，加入等量冰冷异丙醇，冰浴沉淀10min后，在4℃下12300离心10min。
弃上清液，沉淀用500μL 70%的乙醇洗两遍，干燥后，用100mL ddH2O溶解，最后在-20℃贮备。
1.3DNA的纯化与不同浓度DNA溶液的配制将提取的大豆基因组DNA通过电泳，切取后用上海生物工程公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化，并用BioMate5Unicom紫外分光光度计定量后，稀释成不同的浓度。
1.4引物序列巢式PCR引物设计参考van Hoef等[4]，在Primer Primer5.0引物设计软件上对引物序列做了一些改动。
第一对引物扩增343bp片段，其中引物FristF在花椰菜花叶病毒启动子区域，FristR在叶绿素转移肽编码基因区域：FristF：(5'TGTGCT GTA GCC ACT GAT GC3')；FristR：(5'TGATGTGATATCTCCACTGAC3')。
第二对引物扩增147bp片段，其中SecondF在花椰菜花叶病毒启动子区域，SecondR 在叶绿素转移肽编码基因区域：SecondF:(5'TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3')；SecondR:(5'CTGACGTAAGGGATGACGC3')。
半巢式PCR引物设计参考Carolyn等[5]，在Primer5.0引物设计软件上对引物序列做了一些改动。
SPA:(5'CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTC3')；SPB:(5'CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC3')；SPC:(5'TTGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3')。
其中，SPA/B引物扩增320bp片段；SPA/C引物扩增120bp片段。
用于巢式PCR扩增大豆Lectin基因的引物：第一对引物扩增412bp片段：FSL1(5'GATGGATCTGATAGAATTGAC3')；RSL1(5'GCCGAAGCAACCAAACATG3')。
第二对引物扩增112bp片段：FSL2(5'CATCTGCAAGCCTTTTTGTG3')；RSL2(5'CTCTACTCCACCCCCATC3')。
1.5PCR反应条件反应为25μL体系：1×PCR反应Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.3U聚合酶(大连宝生物公司)，引物浓度0.4μmol/L，4种dNTP各200mmol/L，DNA模板按如下加入。
巢式PCR，第一轮PCR反应：3.4×10-7g/μL，3.4×10-8g/μL，3.4×10-9g/μL，462第5期黄昆仑等：用巢式和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready 及其深加工食品3.4×10-10g/μL ，3.4×10-11g/μL ，3.4×10-12g/μL ，3.4×10-13g/μL ，3.4×10-14g/μL ，无菌水,各加5μL ，不足部分用无菌水补足25μL ；第二轮PCR 反应:用第一轮PCR 反应产物作为模板，分别加入1μL 产物,不足部分用无菌水补足25μL ；半巢式PCR 与巢式PCR 相同。
