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转基因耐除草剂大豆 ZH10-6多重 PCR检测方法的建立摘要本研究通过利用多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术，检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性鉴定方法，为该转化体的生物安全评价研究以及知识产权保护和市场行政监管提供重要的基础技术支撑。
关键词：转基因耐除草剂大豆ZH10-6；多重PCR；检测方法1、材料与方法1.1材料转基因耐除草剂大豆(Glycinemax)ZH10-6，非转基因大豆受体ZH10，用于特异性测试的样品有：转基因玉米(Zeamays)混样(MON810，MON863，Bt11，Bt176，GA21，T25，NK603，TC1507，MON88017，3272，MON87427，MON87460，MIR162，MIR604，DAS40278-9，MON89034，4114，59122，5307，BVLA430101每种转化体含量分别为1%，以非转基因玉米作为填充物)；转基因大豆混样(MON87701，MON89788，GTS40-3-2，A2704-12，A5547-127，CV127，356043，305423，MON87769，MON87705，MON87708，FG72，DAS44406-6和SYHT0H2每种转化体含量分别为1%，以非转基因大豆作为填充物)；转基因油菜(Brassicanapus)混样(包括RT73，MS1，MS8，T45，RF1，RF2，Topas19/2，RF3，Oxy235，MON88302，每种转化体含量分别为1%，以非转基因油菜作为填充物)。
1.2仪器和主要试剂LEGENDMICRO21R高速冷冻离心机Ther‐mo；Nanodrop1000核酸定量仪NanoDrop；Veriti96WellPCR仪ABI；电泳仪BIO-RAD；C150凝胶成像系统AzureBiosys‐tems。
植物基因组DNA提取试剂盒DP305；PCR试剂2×GoTaqGreenMasterMix;DL1000DNAMarker;琼脂糖;SuperGelred10000×inwater；引物由GE‐NEWIZ合成。
转基因大豆技术流程嘿，朋友们！今天咱来聊聊转基因大豆技术流程那些事儿。
你看啊，转基因大豆就像是一个被精心打造的小宝贝。
首先呢，科学家们得找到那些有着优良特性的基因，这就好比是在一堆宝贝里挑出最闪亮的那颗宝石。
然后呢，把这些选好的基因通过一些神奇的手段，放到大豆的基因组里。
这就好像是给大豆穿上了一件特别厉害的铠甲。
在这个过程中，可不能随随便便就乱来。
就像盖房子得打牢地基一样，每一步都得小心翼翼。
比如说，怎么把基因准确地放进去，放进去之后怎么保证它能发挥作用，这些都是大问题呢！接着呀，就是要让这些转基因的大豆长大啦！给它们合适的土壤、水分、阳光，就像照顾小朋友一样细心。
然后看着它们一点点长大，开花、结果。
这时候你就会想，哎呀，这可真是不容易啊！等到大豆成熟了，收获的时候也得注意。
不能把好的坏的都混在一起，得精挑细选。
这就跟咱挑水果似的，得挑那些又大又甜的。
收获之后呢，还得进行各种检测，确保这些转基因大豆真的是安全可靠的。
你说这转基因大豆技术神奇不神奇？它能让大豆变得更优秀，产量更高，品质更好。
这就好像是给大豆施了魔法一样！那我们以后是不是就能吃到更多更好吃的豆制品啦？不过呢，也有人会担心转基因的东西会不会有啥不好的影响。
但咱得相信科学家们呀，他们肯定会把好关的，不会让咱吃到不安全的东西。
而且，转基因技术也不是随随便便就用的，那都是经过严格审查和监管的呢！总之呢，转基因大豆技术流程就是这么一回事。
虽然听起来有点复杂，但其实也挺有趣的。
就像生活中的很多事情一样，只要我们用心去了解，就会发现其中的奥秘和乐趣。
咱也别害怕这些新科技，要以开放的心态去迎接它们，说不定它们能给我们的生活带来更多的惊喜呢！。
转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月目录前言........................................................................3. 实验一大豆样品的准备 (4)实验二大豆DNA的提取和纯化 (4)实验三靶标基因的扩增 (6)实验四反应产品检测 (10)实验五结果分析 (12)参考文献 (12)前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。
普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通PCR。
因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
1 引言转基因大豆(genetically modified soybean，或biotech soybean)，简称GM大豆，是指利用转基因技术，通过基因工程方法导入外源基因所培育的具有特定性状的大豆品种。
1994年5月，美国孟山都公司培育的抗草甘膦除草剂转基因大豆(商品名为Roundup Ready大豆，简称RR大豆)首先获准在美国商业化种植。
草甘膦是一种高效、低毒、广谱类除草剂，它能杀死所有绿色植物，但对动物、微生物无毒。
草甘膦能破坏5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-膦酸合成酶(EPSP合成酶)，这种酶是合成苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、酪氨酸的关键酶，当草甘膦抑制EPSP 时，这几种氨基酸不能合成，就破坏了蛋白质的正常代谢，结果导致植物死亡。
研究发现，矮牵牛植物体内的EPSP酶有特异性，草甘膦杀不死矮牵牛。
专家们应用转基因技术，把矮牵牛DNA链中EPSP基因导入高产大豆品种的DNA链中，进而育成具有抗草甘膦除草剂特性的转基因大豆品种。
此外，Aventis 公司获准推广抗广谱除草剂Glufosinate的转基因大豆。
杜邦(Dupont)公司于1997年获美国食品药物管理局(FDA)批准，推广高油酸(70%)转基因大豆。
目前，低亚麻酸(2%)大豆、低棕榈酸(4%)大豆、高硬脂酸(28%)大豆、高棕榈酸(27%)大豆等转基因品种也已在美国培育成功。
美国是全球最大的转基因大豆生产国，在最近两年世界转基因大豆种植面积份额中，美国约占55%，列全球第一；阿根廷约占30%；巴西约占10%；巴拉圭约占3%。
从转基因大豆种植率来看，从2001年起，阿根廷国内种植的大豆几乎全部是转基因大豆，转基因大豆种植率接近100%，是全球第二大转基因大豆生产国；2004年，美国转基因大豆种植率达85%；巴西政府2003年批准转基因大豆的商业化种植，即成为全球第三大转基因大豆生产国，2004年种植率达22%，占全球转基因大豆种植面积的10.3%。
转基因食品检测技术分析作者：邓珍丹来源：《中国食品》2021年第13期基因工程于上世纪70年代左右出现，该项技术能够以人的意愿为根据，改造出处于理想状态的生物，当前在全世界范围内已经有大量的转基因植物在种植，其中包括棉花、玉米、大豆、油菜等。
虽然从整体上来看，转基因食品的发展十分迅速，但其中一直存在食品安全问题，所以，当前社会各界仍对转基因食品安全中可能存在的隐患予以高度重视，并不断发展各种转基因食品检测技术。
一、转基因食品概述所谓“转基因”，也就是采用DNA重组技术使外源性的基因可以转移至其他生物体之中，并促使生物体呈现出与既往不同的生物性状以及遗传特征，从而实现基因的重组，并形成新生物体。
转基因食品也就是由基因重组生物体经过加工而形成的食品。
通过转基因技术的应用，作物生长周期可缩短、产量可提升，同时抗病虫害的能力更强，也更有利于降低生产成本。
虽然当前尚未在转基因食品中发现大量毒素存在，但因为其中的基因以及DNA重组难以得到有效控制，所以转基因的安全问题难以得到有效保障。
二、转基因食品存在的隐患近几年来，市场上的转基因食品数量越来越多，从整体上来看，其中的安全隐患主要体现在以下几个方面：（1）转基因食品属于基因重组构成的新生物體，当前还不能确定其中的成分以及结构是否发生改变。
（2）转基因食品非自然生长，若长期食用转基因食品，可能导致人体出现过敏甚至中毒等情况。
（3）部分转基因作物中存在细菌基因，能够导致害虫或是昆虫出现不正常发育的情况，甚至在生长过程中发生死亡，导致生物链受到不良影响。
（4）转基因作物不具有规律的基因序列，可能导致生物资源受到影响，进而导致环境甚至生态平衡被破坏。
正因为转基因食品存在以上隐患，因此需要相关工作人员强化对于检测技术的研究，科学且规范地对转基因食品开展监管工作，并解决相关的安全问题。
三、转基因食品检测技术的主要类型1.蛋白质印迹检测技术。
通过聚丙烯酰胺凝胶电冰对外源的蛋白质进行分离，根据蛋白质及显色酶反应完成检测。
PCR检测转基因大豆：[目的]定性检测转基因大豆。
[方法]以非转基因大豆和CP4-EPSPS 转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为检测的目的片段,建立PCR反应体系。
采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA, 并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立：采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R 的定量PCR检测方法。
该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 0倍用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品：用从转基因大豆(Glycinemax )颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。
结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10-14g/μL的溶液。
用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeepinggene)。
ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究：以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。
此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4 EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。
转基因食品的安全性评价及检测技术进展王桂才【摘要】就转基因食品的安全性、转基因化生物的检测进展以及对转基因食品安全性的评价进行了综述,最后对转基因食品未来的发展进行了展望.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2012(033)005【总页数】3页(P220-221,236)【关键词】转基因食品;危害;检测;评价【作者】王桂才【作者单位】天津市静海县产品质量技术监督局,天津301600【正文语种】中文据有关方面的预测，到2010年，全世界的转基因食物的种植面积将增至6000万hm2，市场总收入将达到3万亿美元，其种子收入将达到1200亿美元。
因而可以毫不夸张地说，转基因食品的新时代已经到来[1]。
本文就有关转基因生物和食品存在的安全性问题、检测和评价研究综述如下。
1 转基因食品的危害GMO是一种或几种植物或动物乃至人类的基因植入某一种生物，从而表现出本身自然不能拥有的由转入基因带来的新特性，达到改善其产品的品质、提高营养成份、增加其抗病、虫、害、增加产量、抗逆转、延长货架期等。
转基因食品（GeneFood）是以转基因生物为原料，加工为人类所食用的产品。
1.1 卫生危害1.1.1 未进行较长时间的安全性试验基因化食品改变了我们所食用食品的自然属性，它所使用的生物物质不是人类食品安全提供的部份，未进行长时间的安全试验，这类食品的安全性是未知的。
1.1.2 产生毒素基因化食品能产生不可预见的生物突变，会在食品中产生较高水平的新的毒素。
Losey，J.E.等报道，在一种植物马利筋叶片上撒有转基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用叶片就少，长得慢，4 d的幼虫死亡率44%。
而对照组（饲喂不撒Bt玉米花粉的叶片）无一死亡。
转基因作物产生的杀虫毒素可由根部渗入周围，但尚不清楚会产生何种影响。
1.1.3 过敏或变态反应基因技术会在食品中产生不能预见的和未知的变态反应原。
据报告，对巴西坚果产生过敏的主体也会对用该坚果基因工程化而得到的大豆产生过敏。
转基因大豆检测技术研究进展 [摘要] 大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。由于转基因产品的安全性在世界范围内引起广泛关注，对转基因检测技术的要求也越来越高，因此,对转基因大豆检测技术的研究成为近年来研究的热点。重点介绍以蛋白质和核酸为目标的检测技术，如EI。ISA、PCR和基因芯片技术的最新进展，并对不同方法的优缺点进行比较，为转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。 [关键词]转基因大豆；检测技术；蛋白质；核酸 Abstract：
Soybean transformation research is a/hot spot0in the area
of plant molecular genetics. Transgenic soybean has become the important power of soybeans industry development in the worlds' major producers of soybean. The different points on potential ecological risks and the impact of transgenic products on human health attracted worldwide attention． With the increase of transgenic products， the transgenic detection technology requirements should be established and perfected． The advance in detection techniques of transgenic soybean were summarized focusing on the protein and nucleic acid for target detection technology，such as new research on ELISA，PCR and gene chip techn0109y，and their characteristic were compared to provide references for transgenic soybean fast detection selection，improvement and subsequent research． Key words：transgenosis soybean；detection technology；protein；nucleic acid. 转基因大豆，是指利用转基因技术，通过基因工程方法导入外源基因所培育的具有特定性状的大豆品种。转基因大豆是种植面积最大的转基因作物，而随着转基因作物及其产品的大规模商业化，其安全性以及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注，对转基因成分的检测越来越受到重视。为此，对转基因大豆检测技术进行了综述，并对其优缺点进行比较，以期对转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。 1 转基因大豆发展现状 近年来,由于转基因技术突破了生物物种间遗传物质转移和交换的天然屏障,使人类从对生物的简单认识和利用进入了可以按自己的意愿改造和创造新种质的时代。转基因技术打破了常规育的各种局限,并且得到迅猛发展和不断完善,现已成为大豆品质改良育种主要的且最有前途的技术手段。自从世界第一例转基因烟草1983年在美国问世以来,国际上已有30多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达40多种。转基因大豆品种的育成和推广是世界大豆科技史上具有里程碑意义的重大突破,产生了巨大的经济效益和广泛而深远的社会影响,已成为世界大豆生产发展的主流趋势。目前我国已正式批准棉花、西红柿、烟草和牵牛花4种转基因作物进行商业化生产,但真正商业化生产的转基因作物只有棉花,转基因水稻的安全评价已经进入到了最后阶段。转基因大豆、玉米等转基因作物正处于中间试验和环境释放试验阶段,进入商业化推广的准备阶段。该文综述我国转基因大豆遗传转化再生体系、遗传转化方法、目的基因类型的研究进展及其产业化现状,并就我国转基因大豆的未来发展前景进行了展望。 2 转基因大豆检测技术 为了满足强制标识的要求，各国政府在转基因检测领域投入大量的人力和物力，不断完善检测技术。目前，转基因大豆的检测方法主要以蛋白质检测和核酸检测为主。 2．1 蛋白质检测 2．1．1 ELISA法 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机结合起来的一种高灵敏度的检测技术。Rogan等建立了检测转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质的ELISA方法，国内自卫滨等应用E1．ISA方法成功检测出美国、阿根廷，巴西转基因大豆含量分别为3．8％、2．8％和1．9％。ELISA方法具有简便、快速、成本低等优点，但复杂基质对其准确性有干扰，而且不能检测深加工产品中的转基因成分。 2．1．2 试纸条法 将特异的抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再与带有颜色的特异抗体进行反应，形成三明治状的色带，如果没有抗原。则无颜色反应。丁耀魁等眵3采用快速检测试纸条测定大豆转基因含量，测定时间仅需10 min，测定结果准确。其检出限可达0.1％。试纸条法操作简便，不需要特殊的仪器设备，适用于现场检验或初筛。该法的缺点是检测范围较小，转基因食品中的蛋白质抗原性加工后容易被破坏，影响检测结果的准确性。 2．1．3 SDS–PAGE法 SDS–PAGE法是根据蛋白质亚基分子量的不同来分开蛋白质。大豆在引入外源基因后，会表达相应的蛋白质，可以通过比对蛋白质电泳图谱来区别转基因大豆与非转基因大豆。武泰存等采用PCR和SDS–PAGE两种方法对转基因大豆和非转基因大豆进行检测比较发现，SDS–PAGE和PCR检测结果吻合，转基因大豆在蛋自质电泳中出现约40 kDa的蛋白带，而非转基因大豆则没有。金红等研究发现，转基因大豆中大约45kDa蛋白带的表达量明显强于非转基因大豆中相对应的蛋白带。SDS-PAGE的优点是体系中外来影响因素少，检测结果较稳定，重复性好，缺点是操作较复杂、检测时间较长。 2．2 核酸检测 2．2．1 PCR法 PCR方法是适应性最广、灵敏度较高、技术较成熟的一种检测核酸的方法。钱翔宇等采用改进的CTAB法提取大豆基因组DNA，用普通PCR方法检测到转基因大豆特异性片段CP4一EPSPS，当转基因大豆含量为0.2％时。仍然可以检出；张秀丰等建立了以CaMV35S、NOS、NPT II、CP4一EPSPS外源基因和大豆内源基因(Lection)为榆测目的片段的5重PCR检测方法。陈彦等将降落PCR与热启动相结合，检测出0.01％转基因成分的大豆基因组外源基因CaMV35S和NOS。敖金霞等建立了适用于转基因大豆、玉米和水稻深加工产品定性检测的S重巢式PCR检测方法，其检测灵敏度为O．005％。相对于普通PCR，多重PCR一次反应能够检测多个目的基因片段，可以检测多个品系的转基因成分；降落PCR的程序设计虽然繁琐．但该方法明显提高了PCR扩增的特异性和效率；巢式PCR应用多条引物，通过二次PCR扩增，大大提高了检测灵敏度。 2．2．2 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术(Loop—mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种新颖恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃)下保温几十分钟。即可完成核酸扩增反应。柳毅等以CP4一EPSPS外源基因为检测的目的片段，进行LAMP扩增，检测已知转基因大豆和市售大豆，通过肉眼观察白色沉淀，判断检测结果，LAMP技术对转基因大豆的检出限为O．01％。田芳等应用LAMP技术对大豆、豆粕及含有大豆成分的饲料样品进行检测成功检测出CP4一EPSPS基因，灵敏度为PCR方法的100～L000倍。LAMP技术灵敏度高、特异性好、耗时短且对仪器要求不高，目前这项技术也广泛地运用到病原菌检测之中。缺点是引物设计较为复杂，对扩增产物处理不当容易造成污染，影响后续的检验结果。 Z．2．3 荧光PCR技术 荧光PCR技术是一种可用于定性或定量的PCR方法，在转基因产品检测上已得到广泛应用，主要有非特异性染料结合和荧光标记探针2种方法。王小花等建立了大豆转基因成分的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法，通过熔解曲线分析扩增反应特异性，检测限为0.01％。黄俊明等口叫针对转基因大豆外源基因CP4一EPSPS基因建立实时荧光定量PCR方法及标准曲线，对市场抽检的豆奶粉、素鸡、香肠等12种豆类制品进行含量分析，其中，五香茶干、豆奶粉、素鸡,香肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2．46％、6．26％、13．95％、0.48％和0.66％，其余7份样品为阴性。自卫滨等用荧光定量PCR技术成功检测出美国、阿根廷、巴西转基因豆粉和中国豆粉的转基因成分，其灵敏度为0.001％。尽管荧光染料技术成本低廉,但具有非特异性，实际检测中通常采用荧光探针技术。荧光PCR技术具有快速、灵敏、准确、污染少等优点，缺点是对仪器设备要求较高、检测费用昂贵。 2．2．4 基因芯片基因芯片技术 是近年来快速发展起来的分子生物学高新技术。在转基因检测中。将目前能用的报告基因、启动子、终止子的特异性片断制成检测芯片，与待测产品的DNA进行杂交，扫描信号后经计算机软件分析，判断待测样品是否为转基因产品。Germini等L22J利用肽核酸基因芯片对转基因大豆进行了检测。Leimanis等拉副
