紫外线对枯草芽孢杆菌诱变剖析

一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。

2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。

3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。

二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。

紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。

三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。

2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。

3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。

四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。

2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。

3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。

4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。

5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。

6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。

7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。

五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。

2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。

实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。

二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。

2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。

3.练习单菌落划线分离微生物。

二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。

而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。

温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。

微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。

粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。

常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。

根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。

常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。

许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。

不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。

产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。

青霉素主要抗G＋细菌。

链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。

链霉素以抗G－细菌为主。

紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。

另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。

紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。

紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。

紫外线对枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的诱变效应一．实验目的1.观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生蛋白酶的诱变效应2.学习并掌握物理诱变育种的方法。

二.原理物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。

一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。

紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。

因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。

紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。

紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。

但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。

经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。

另外，照射处理后的菌液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。

三.主要仪器设备与试剂1.菌种：枯草芽孢杆菌BF7658。

2.培养基：①菌体培养基：LB ②初筛培养基：酪蛋白0.5% 葡萄糖0.1% 酵母膏0.1%磷酸氢二钾0.1% 磷酸二氢钾0.05% 琼脂2%3. 主要药品：0.9%氯化钠4. 主要器皿：锥形瓶、50ML离心管、20 W 紫外灯、离心机等。

四.实验方法与步骤1.将过夜培养的枯草芽孢杆菌菌液1mL接种于新鲜LB培养基中2.菌悬液的制备：把对数生长期的菌悬液于2000 r/min离心10 min，倒掉上清液，收集到的菌体用约40mL己灭菌的生理盐水洗涤后，重悬约40 mL生理盐水制备菌悬液。

实验六紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶的诱变效应、抗菌素生物效价的评价及裂解性噬菌体效价测定（-----结果分析）•实验目的与要求：•1、学习并掌握物理诱变——紫外射线诱变育种的方法。

学习并掌握计算诱变后存活率及致死率的计算。

学习透明圈和菌落直径大小及HC比值计算。

•2、学会裂解性噬菌体效价测定方法。

•3、学会抗生素效价测定方法及利用检定菌检测微生物代谢产物的抗菌性。

一、紫外诱变枯草芽胞杆菌效应• 1.紫外诱变过程：•紫外线诱变采用15W紫外线杀菌灯；在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热；灯与处理物的距离为30cm；无菌取菌悬液使其厚度为0.5～1.0cm，放在紫外灯的照射台上，开启电磁搅拌器开关。

操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

•照射时间：未照射前（0时），照射1min，照射2min，照射3min时分别取样0.5ml；每照射到时间马上无菌取样，加到已经编号的第1个试管，为10-1，共有4个时间的10-1 ，分别将其稀释至：•0min 1min 2min 3min•稀释度10-610-710-8 10-610-710-8 10-510-610-7 10-410-510-6•每个稀释度各取0.2ml涂平板，共涂12块平板，做好标记，37℃培养48hr。

• 2.计算致死率•（1）对照样品中活菌数：将培养至48h后对照古板取出进行细胞计数，根据平板上菌勤务员落数，计算出对照样品1ml菌液中的活菌数。

同样方法数出紫外线处理1、2、3min后的细菌数。

•（2）致死率计算：（3）画出致死率曲线：横坐标为照射时间，纵坐标为致死率。

• 3.观察诱变效应•在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

•分别测量透明圈菌落计算比值（HC值），与对照平板进行比较。

二、抗菌素滤纸片法测定生物效价• 1.实验操作过程：•（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基灭菌融化，倒平板凝固后，用无菌吸管吸取培养好的试验菌液0.2ml，采用涂布法均匀涂于平皿表面。

实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。

二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。

2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。

二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。

本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。

三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。

将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。

照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。

2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。

取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。

观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。

3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。

五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。

2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。

3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。

六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。

2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。

3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。

七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。

2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。

紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选马加强，吴明，马礼鹏，刘博*【摘要】摘要：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌，具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点，是一种重要工业酶和工业制剂的菌种，被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。

为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。

对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，简称α-ALDC)、3-羟基丁酮(Acetoin)和葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate，简称G-1-P)能力的条件进行了比较。

【期刊名称】安徽农业科学【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4【关键词】枯草芽孢杆菌；紫外线诱导；酶制剂；3-羟基丁酮；葡萄糖-1-磷酸枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，呈直杆状，内生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黄色，表面粗糙，可将体内生产的蛋白分泌到胞外。

枯草芽孢杆菌广泛分布于土壤、动植物表面和湖波海洋中，正是因为其生活环境的多样化，可以利用多种环境中丰富的物质，所以细菌体内有丰富的产酶系统，具有产生多种酶的潜力，可以生产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶木、聚糖酶、纳豆激酶、维生素、寡糖、小肽、氨基酸、增味剂、葡萄糖-1-磷酸和3-羟基丁酮等，应用于食品、纺织、医药、科研、造纸、皮革、环保与饲料养殖中[1-4]。

枯草芽孢杆菌是经我国农业部认定的2种饲料添加菌种之一，也是美国食品药物管理局(FDA)认定的安全菌种[5]。

枯草芽孢杆菌是工业酶生产的主要菌种之一，仅有由其生产的蛋白酶、淀粉酶。

其中，脂肪酶就占据整个酶市场的50%以上[1,3]。

在食品领域，枯草芽孢杆菌生产的酶占世界食品工业酶总量的60%以上，在我国食品工业酶中由枯草芽孢杆菌生产的酶占85%以上。