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一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。
而我国由于受人口多、耕地少的双重制约，粮食供应形势尤为严峻。
因此，我国畜牧业要稳定持久发展，就必须减少对粮食的依赖[1]。
一株产纤维素酶细菌紫外线诱变研究郑哲;贾翠英;张玉辉【摘要】A bacterium strain producing cellulase was investigated by UV mutation in this paper. The influenced factors of mutation time , mutation distance , cell concentration and cell growth cycles on ratio of cell death and cellulose activity were studied. Through the cellulose-Congo red cultivation and fermentative medium cultivation experiment, the optimal mutative condition was obtained, which was 180s mutation time , 25cm mutation distance, 10-5 diluted cell concentration and 24h cultivated cell. Under the optimal condition,the strain statically cultivated for 2 days , the highest cellulase activity of 38. 30U/mL was achieved which was much higher 40. 08％than that of original experimental strain, all these resultswill give some remarkable values and references for enhancing cellulose activity.%以一株产纤维素酶细菌为主要研究对象进行紫外线诱变研究,通过考察紫外线诱变时间、诱变距离、菌体浓度和菌龄时其产纤维素酶能力的影响,并用纤维素刚果红培养基进行复筛,然后进行液体静置发酵产酶试验,确定了最适紫外线诱变组合条件.结果表明最适紫外线诱变组合条件为:诱变时间180 s、诱变距离25 cm、菌体浓度为10-5、菌龄为24h,在此条件下进行2d液体静置发酵,其酶活最高值为38.30U/mL,与原始出发菌株相比酶活力提高了40.08%,该研究对提高纤维素酶活性具有一定参考价值和借鉴意义.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】4页(P66-69)【关键词】细菌;紫外线诱变;纤维素酶【作者】郑哲;贾翠英;张玉辉【作者单位】河南科技学院生命科技学院,新乡,453003;河南科技学院生命科技学院,新乡,453003;河南科技学院生命科技学院,新乡,453003【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;Q814;Q55纤维素是地球上最广,含量最丰富的碳源物质,可以被纤维素酶降解成葡萄糖,并进一步的转化为食品、饮料或乙醇等,将对缓解人类目前面临的粮食紧缺和能源危机发挥重大的作用[1-4],因此,纤维素原料是重要的可再生资源和能源。
利用紫外诱变育种选育强降解纤维素真菌的研究
张伟;张海宾;袁正仿;刘慧娟
【期刊名称】《中国医学生物技术应用》
【年(卷),期】2003(000)004
【摘要】以纤维素粉为唯一碳源,从棉籽壳中筛选出能分解纤维素(CMC)的霉菌,利用常规方法鉴定为绿色木霉,通过紫外线诱变提高分解纤维素的能力,采用水解圈和滤纸崩溃法进行初筛,摇瓶培养复筛的方法,筛选出一突变绿色木霉(T118),降解纤维素的能力提高了1倍,CMC酶活性提高了50%,C1酶活性提高了40%,还对该突变株产酶条件进行了研究,得出最适条件为:稻草粉:麸皮=4:1,发酵时间为5d,发酵温度为30℃,该酶最适反应PH为6,最适反应温度为50℃。
此突变株易培养,有利于工业生产,具有重大的实用价值。
【总页数】6页(P37-42)
【作者】张伟;张海宾;袁正仿;刘慧娟
【作者单位】河南信阳464000
【正文语种】中文
【中图分类】S182
【相关文献】
1.两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究
2.细菌纤维素高产菌株的紫外诱变育种研究
3.药用真菌猪苓的紫外线及氦-氖激光诱变育种研
究4.朽木中白腐真菌的选育及对木质纤维素降解性能研究5.紫外诱变育种在瘤胃厌氧真菌中的应用效果研究
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准紫外线诱变育种1.准紫外线诱变育种备孢子悬浮液取新采收的无菌孢子,放入装有生理盐水的三角瓶中(瓶中可放少量玻璃球),摇荡,使孢子分散.孢子液浓度以每毫升含孢子..诱变处理处理要放在能折光的箱中,箱内顶部装15瓦紫外灯管.把孢子液放在培养皿底部.盖好盖,培养皿距灯管30厘米,处理前先开灯30分钟左右,使波长稳定,然后打开皿盖,照射时间为0.5—4分钟(由于各种菌类的孢子不同,照射时间也应有所不同),选定对孢子杀伤在90﹪--99﹪的适当处理时间.照射结束盖上皿盖,稀释,然后取稀释液0.1毫升涂平板,适温黑暗培养,待长出是芒状菌落后立即挑出,供进一步试验用.(二)硫酸二乙脂诱变处理硫酸二乙酯属烷化剂,对人体有毒,使用时要注意安全.1.准备孢子悬浮液同前2.诱变处理取硫酸二乙酯原液2毫升,加乙醇2毫升溶解,吸取0.4毫升硫酸二乙酯溶液放入20毫升孢子悬浮液中,让其作用.作用时间,至数小时不等,选出孢子杀伤在90﹪以上的适当处理时间,采用大量稀适法中止反复.最后取0.1毫升涂平板或斜面,适温培养,挑出星芒状菌落作进一步试验.(三)单孢杂交方法1.分离单孢采集孢子,采用连续稀释法稀释孢子,以达到镜检每视野1---2个孢子为好;涂布平板,,适温培养;挑起单个菌落,继续培养.2.单核菌丝鉴定(1)海登海因氏铁矾苏木精染色法①苏木精处理:取苏木精0.5克,溶于10毫升95%乙醇内,再加90毫升蒸馏水,用纱布扎住瓶口,置光亮处,3—4个月成熟后方能使用.氧化完成的苏木精呈酒红色.为防止苏木精过度氧化,可将苏木精溶于95%乙醇内配成原液,使用前加水稀释.如在乙醇中加少量甘油效果会更好.②媒染液准备:这种染色法要用铁矾作媒染液.配方为铁矾2.5克,溶于100毫升蒸馏水中即可.③褪色剂制备:将上述媒染液加水稀释一倍即可.④铁矾苏木精染色步骤:将石蜡切片从二甲苯经各级乙醇到水,冲洗,媒染1—4小时,蒸馏水洗2—3次,用退色剂处理至镜检细胞核清晰为止.(2)锁状联合鉴定取菌丝镜检,观察3—5个视野,以找不到锁状联合为准,确认为单核菌丝.(3)出菇试验鉴定利用单核菌丝不结实的特征,相同条件下以双核菌丝作对照鉴定单核菌丝.3.杂交采用两点接种法进行杂交,杂交可在平板上也可在试管内进行.方法是将两个不同亲本的单核菌丝分别接种在平板或试管斜面上,两点相距1厘米左右,适温培养,待两亲本菌丝生长入空白试管斜面,培养.镜检有无锁状联合,如有锁状联合说明已杂交上,留下作出菇筛选.4.初筛,复筛,中试推广取有锁状联合的试管,扩制原种,栽培种,进行小面积出菇筛选,为初筛.把初筛中综合性状表现较好的菌株扩大面积进行复筛,选出优良菌株作中试推广.(四)多孢杂交方法1.亲本孢子萌发时间测试分别制备两亲本孢子悬浮液,同时分别接入培养基上,适温培养,定时观察孢子萌动情况,纪录萌动时间.2.孢子杂交根据亲本孢子萌动时间,同时(孢子萌动时间基本一致)或先后接入孢子液同一试管斜面上,培养,当两亲本菌丝接触,发生自然杂交.培养过程中经常检查,见有单菌落出现就挑出,接入马铃薯葡萄糖培养基上培养.3.拮抗试验取杂交菌株与两亲本作3点拮抗试验,选取有2条拮抗线的菌株扩大培养,作初筛,复筛,中试推广.(五)原生质体融合所谓原生质体是细胞去除细胞壁后的细胞核和细胞质的部分.原生质体融合则是把具有一定遗传标记的两种不同遗传类型的原生质体,通过细胞核和细胞质的融合,进行遗传重组成为新的类型的一种方法.它是生物技术领域的重大突破,它为远缘杂交育种开辟了新的途径.1.原生质体制备(1)培养适龄的菌丝体可以用液体培养,也可用试管斜面培养,一般要求生长旺盛的幼嫩菌丝体.如香菇原生质体制备采用25℃液体培养,也可用试管斜面培养4天的菌丝体最佳.培养基以马铃薯葡萄糖酵母粉培养基为最好,不但菌丝生长不好,同时原生质体释放量有也大.(2)酶系统与酶浓度选择真菌细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和几丁质等多糖物质,合适的脱壁酶系统是这些多糖物质降解的关键,常用的有溶壁酶、脱壁酶、蜗牛酶等.中国科学院广东微生物研究所研制的脱壁酶具有较好的酶解效果,香菇菌丝脱壁采用1%脱壁酶,其原生质释放量可达到10/7%毫升以上 . (3)渗透压稳定剂选择脱去细胞壁的原生质体必须在相应的渗透压条件下才不至于破裂,因此,合适的渗透压稳定剂是影响菌丝释放原生质体的重要因素.常用的有0.6摩/升氯化钾、0.6摩/升硫酸镁及0.6摩/升甘露醇.香菇菌丝脱壁的渗透压稳定剂以0.6摩/升氯化钾或0.6摩/升硫酸镁为宜,原生质释放量均在10/7/毫升以上.(4)酸碱度一般担子菌的脱壁在中性条件下效果最好,香菇则要在较酸[氢离子浓度100微摩/升(PH4)]的酶解反应系统中才能达到高的脱壁率.2.原生质体再生脱壁的原生质体虽然失去原有的形态而变成球形,但细胞质膜和整个基因团仍然存在,它具有原来的生理功能,在适宜的条件下,细胞壁能在形成,恢复为一个细胞,在培养基上形成菌落,这就是再生.再生培养基有麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%(MDY)；麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%,菌丝提取液15%(MDYM);纤维二糖1.5%,蛋白胨0.2%,菌丝提取液20%.香菇原生质体再生方法:将制备好的原生质体经过滤和洗涤后,置于再生培养基MDYM中浅层培养(25℃),2天后把开始萌动的原生质体涂布在固体再生培养基表面,经10至15天后即开始出现微小的再生菌落,把这些菌落转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,10至14天可长满斜面.再生滤可达10%左右,若采用再生培养基MDY,则再生率只有1%左右,说明不同营养成分对原生殖体再生的影响.再在生培养中,渗透压稳定剂以蔗糖为好.3原生质体融合(以香菇为例) 将两个单核亲本的原生质体以1：1混合(每个原生质体数目在5×10/6毫升以上),混匀后缓慢加入等体积的聚乙二醇溶液[ 聚乙二醇溶液4000,30%,10毫摩/升氯化钙 ,氢离子浓度3136纳摩/升(PH5.5)],与24℃静止30分钟,用0.05摩/升甘氨酸,50毫摩/ 升氯化钙,氢离子浓度 0.316纳摩/升(PH9.5)的缓冲液冲洗2至3次,稀释后取0.1毫升放入0.5%软琼脂融合子再生培养基中,混匀后把它薄薄地铺在 1.5%琼脂的融合子再生培养平板上,25℃培养.4. 融合子的检出于鉴定待培养基上出现肉眼可见的微小再生菌落时,将其分别转移到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,镜检菌丝有无锁状联合.融合子的鉴定可做以下试验:镜检有无锁状联合;融合子与亲本菌株的拮抗试验;酯酶同工酶谱;多酚氧化酶谱;DNA扩增仪分析;出菇试验.㈥单核和同核原生质体杂方法由于单核和同和原生质体是直接来源于营养菌丝 ,没有经过减数分裂的无性后代,所以这一材料为食用菌的遗传和育种研究提供了一个十分重要的基础材料.单核和同核原生质体与孢子单核体相比,有它自己的特点:它是自己从菌丝体得到的;只存在两种交配型(亲本型AXBX,AYBY);在菌落形态、菌丝生长速度﹑羧甲基纤维素酶相对活性和酯酶同工酶这4种性状上,都具有相对的稳定性,变异范围小,亲本性状不易在单核原生质体中分散和稀释,这就可以使人们在一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的单核体.单核原生质体的这一特点在食用菌菌种改良中具有重要意义,同时也为遗传育种中充分利用野生种质资源提供了一个十分光明的前景.杂交的具体方法:同前法制备原生质体.分别取不同亲本的单核原生质体进行杂交(杂交方法同单孢杂交),得到杂交株后进行初筛﹑复筛,中试推广.(七)单双核杂交方法选用两个亲本,其中一个用其双核菌丝,另一个分离单核原生质体,在平板上先接种单核原生质体,待菌落长到1厘米左右时,相距0.5∽1厘米处接种双核菌丝,适温培养.数天后,挑取单核菌丝一边.少许菌丝镜检,如有锁状联合,说明已杂交成功,可行扩管培养,进行筛选.四﹑基因工程育种基因工程就是基因水平上的遗传工程.它是用人工方法把人们所需要的某一供体生物的遗传物质---- 脱氧核糖核酸(DNA)大分子提取出来,在离体条件下切割后,把它和作为载体的脱氧核糖核酸分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,以让外来的遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得符合人们预先设计要求的新物种.基因工程主要包括以下步骤︰准备材料,如“目的”基因﹑载体及工具酶等;体外重组;载体传递﹑复制表达.基因工程育种在医﹑工﹑农方面有较多的研究,食用菌育种上研究甚少.。
实验一工业微生物的筛选和紫外诱变育种一．实验目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验原理：根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。
三．培养基及仪器：降解亚硝酸盐培养基：NaNO2 0.2%，KH2PO4 0.7%，MnSO4.H2O 0.25%，Na2HPO4 1.35%，MgSO4.7H2O 0.1%，葡萄糖1％，琼脂2％，0.1MPa灭菌20分钟。
6个250ml三角瓶，各装100ml培养基。
同时灭菌试管20支，1ml吸管12支，普通平皿60个，灭菌生理盐水。
培养亚硝酸盐降解菌发酵液1瓶，每位同学准备1个斜面。
3．洁净工作台、培养箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。
四．操作方法课前半小时打开超净工作台灭菌。
1.土壤中降解亚硝酸盐细菌的筛选分离稀释土样。
5g土样，加入45ml无菌水中。
为10-1，然后取1ml加入9ml无菌水，为稀释10-2，直至稀释至10-8溶化培养基。
将溶化后不烫手的培养基倒入平皿，刚好盖过平皿底部，迅速摇匀后放置，使培养基冷却，要求平皿培养基表面平整、光滑。
吸取10-4，10-5或10-6相应浓度的土样稀释液0.5ml，加入平皿内，用烧过灭菌的曲玻棒均匀涂平，放入37℃培养箱中倒置培养48小时。
2.亚硝酸盐分解菌的紫外诱变育种取10ml培养好的液体培养液，放入90 mm培养皿，将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上,置于30 W 紫外灯下，照射90 s，用无菌生理盐水稀释至10-6，10-7，10-8，按常规方法涂布筛选平板。
同学可自行选择培养亚硝酸盐降解菌和诱变菌。
每位同学做一个平皿。
并标记好稀释度、种类和名字。
五、实验进程安排及结果分析（1）第1次实验：稀释土样，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中；或进行菌种诱变，稀释诱变菌，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中。
产纤维素酶菌株的诱变育种一、实验目的：掌握紫外线诱变选育产纤维素酶产生菌的一般方法二、实验内容：最佳诱变剂量的确定：出发菌株的制备；诱变条件选择；稀释涂布并计算致死率。
在最佳诱变剂量下选育发生纤维素酶产量发生正突变的菌株。
三、实验要求：注意紫外诱变菌种选育的操作要点，防止光修复的产生，掌握筛选正突变的实验方法，并绘制时间和致死率之间的关系。
四、实验原理本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种五、实验材料及器材：纤维素产生菌紫外线灯三角瓶 PDA平板镜头纸平板培养皿 pH = 7. 0 的磷酸缓冲液和pH = 4. 4 的醋酸缓冲液玻璃珠黑纸恒温摇床涂布器六、实验步骤：1、孢子悬液的制备用pH = 7. 0 的磷酸缓冲液和pH = 4. 4 的醋酸缓冲液分别冲洗下斜面孢子,倒入装有玻璃珠的三角瓶中, 28 ℃下振荡30 min. 用血球计数板计数, 并稀释孢子浓度为1 ×10^9 ～5×10^9个/ L.2、在距功率15 W 的紫外线灯30 cm 处,将产纤维素酶菌株的孢子悬浮液分别照射4 min、6 min、8 min ,各涂3 个平皿,每个平皿接菌液0. 2 mL ,均匀涂布于平皿培养基.3、取未经紫外线处理的菌液,稀释至同样的浓度,作为对照,记为P.4、将上述平皿编号后用黑纸包好,置于30 ℃温箱,恒温培养72 h 后,进行菌落计数.5、根据对照平皿上的cfu 数,计算出每毫升菌液中的cfu 数,并计算出各皿的致死率6、实验重复3 次,结果取其平均值,并选取纤维素水解圈与菌落直径比值最大的菌落,编号后转接于斜面。
7、时间与致死率图像的绘制：将菌悬液在UV下照射不同时间5、10、15、20、25min，按不同稀释梯度涂布接种于平板初筛培养基。
加大照射时间，测定每个时间点的致死率，绘制时间与致死率关系的图像。
微生物紫外线诱变育种的一般流程微生物紫外线诱变育种啊，这可挺有趣的呢。
一、出发菌株的选择。
这就像是选种子一样，咱们得挑个好的出发菌株。
这个菌株得是那种本身就有点潜力的，比如说它在某些方面已经表现得还不错了，像是生长速度还行啦，或者对环境有一定的适应能力之类的。
要是一开始就选个病恹恹的菌株，那后面再怎么诱变可能都白搭。
就好比你要培养一个运动员，你得先找个身体素质有点基础的人，不能找个整天生病的呀。
二、菌悬液的制备。
把选好的菌株弄成菌悬液，这就像是把种子泡在水里，让它们能均匀地分布。
这个菌悬液的浓度可不能太浓也不能太稀哦。
太浓了呢，紫外线可能照不均匀，就像一群人挤在一起，有些地方晒得到太阳，有些地方晒不到。
太稀了呢，那最后得到的突变体可能就太少了。
一般来说，咱们得根据经验或者查一些资料来确定这个合适的浓度。
在制备菌悬液的时候，还得注意保持菌株的活性，就像照顾小宝贝一样，环境得适宜，营养也不能少，可不能让它们在这个时候就挂掉了。
三、紫外线照射。
这可是关键的一步呢。
就像是给这些微生物来一场刺激的阳光浴，不过这个阳光可是紫外线。
咱们得把菌悬液放在紫外线灯下照射。
这个照射的时间和距离都很有讲究哦。
照射时间太短，可能诱变效果不明显，微生物还是老样子。
照射时间太长呢，那微生物可能就被紫外线给“晒死”啦，就像人在太阳下晒太久会中暑一样。
距离也很重要，离得太近，紫外线强度太大，离得太远，强度又不够。
而且在照射的时候啊，最好能让菌悬液不断地晃动，这样能保证每个微生物都能比较均匀地接受紫外线的洗礼。
四、后培养。
经过紫外线照射后的微生物可都是“受过伤”的小宝贝啦。
这时候要把它们放到合适的培养基里进行后培养。
这个培养基就像是一个温馨的小窝，给它们提供营养，让它们慢慢恢复，并且在这个过程中表现出那些因为诱变而产生的新特性。
在这个阶段，咱们得密切观察微生物的生长情况，看看有没有出现一些特别的变化，比如说生长速度突然变快了，或者对某种物质的代谢能力变强了之类的。
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案： 纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱诱变出高产纤维素酶的菌种。
变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×200~300×10nm10nm ，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1） 菌种：木霉单孢子 （2） 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3） 器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml ）,150ml 三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4） 仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：单孢子悬液制备： 用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散摇床上震荡分散30min 30min 30min，，4 4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成将未经照射的菌液稀释成10-1~10-610-1~10-610-1~10-6，，然后从然后从10-5,10-610-5,10-6两管中各吸取两管中各吸取0.1ml 0.1ml 0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于3232度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，度条件下培养过夜，第二第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。
这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。
在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。
菌株需要1。
内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。
2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。
随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。
只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。
就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。
只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。
从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。
使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。
毕业论文题目：诱变育种提高纤维素酶产生菌的产酶效率的研究学院：专业：生物工程学生姓名：学号：指导教师：职称：副教授题目类型: ☐理论研究☑实验研究☐工程设计☐工程技术研究☐软件开发2016年5 月30 日本研究主要是以课题组前期筛选出来的产酶能力较高的霉菌21-29为出发菌株，对其进行硫酸二乙酯和紫外的复合诱变选出正突变菌株。
首先对进行硫酸二乙酯诱变选出正突变菌株；然后以选出的正突变菌株为出发菌株，对其进行紫外诱变选出正突变菌株；最后再对选出的正突变菌株进行固体发酵。
通过单因素实验优化菌株产纤维素酶的发酵条件，分别考察了发酵时间、接种量、C：N和种龄对纤维素酶酶活力的影响，得出最佳的发酵条件；用优化的发酵条件来对选出的菌株进行传代培养来确定其遗传稳定性，确定菌株是否能应用于生产。
结果表明：通过硫酸二乙酯诱变选出的正突变菌株DES-1，液体发酵酶活达到0.2273 U/ml，比未诱变的出发菌株21-29提高了11.4%。
通过紫外诱变选出的正突变菌株UV-1，酶活达到0.2231U/ml，比未诱变的出发菌株DES-1提高了27.4%。
该菌株最佳固体发酵条件如下：发酵时间为5天，接种量为15%，C：N为4:1，种龄为72h，pH为5.0。
酶活分别为2.2426U/g，2.5201U/g，3.0803U/g，2.8037U/g，2.8037U/g 。
对UV-1 传代培养后菌株的酶活相差不大，故其具有较高的遗传稳定性。
关键词：纤维素酶；固体发酵；紫外诱变；硫酸二乙酯诱变This study is based on our previous screening out high enzyme production capacity of 21-29 mold as the original strain, the positive mutant strains being elected by ultraviolet and diethyl sulfate complex mutagenesis.First, It is subject to being elected by diethyl sulfate mutagenesis a positive mutant strain. Then the positive mutant was selected as the starting strain,and the positive mutation was selected by UV mutagenesis.Finally,the positive mutant strain was selected to carry out the solid fermentation.The fermentation conditions of cellulase production by single factor experiment were investigated. The effects of fermentation time, inoculum amount, C:N and age on the cellulase activity were investigated, and the optimum conditions were obtained.Then the optimal fermentation conditions were used to determine the genetic stability of the selected strains and determine whether the strains could be used in production. The results showed that the positive mutant strain DES-1 was induced by diethyl sulfate mutagenesis, and the Liquid fermentation enzyme activity reached 0.2273U/ml, which was increased by 11.4%. than that of the original strain 21-29.Selected by UV mutagenesis of the positive mutant strain UV-1, the enzyme activity reached 0.2231U/ml, which was improved by 27.4%. compared with the non mutagenic starting strain DES-1.The strain optimum Solid fermentation conditions were as follows: fermentation time was 5 days, inoculum was 15%, C: N was 4: 1, seed age was 72h, pH was 5.0. Enzyme was 2.2426U / g, 2.5201U / g, 3.0803U / g, 2.8037U / g, 2.8037U / g.The enzyme activity of the strain UV-1 after subculture was not Has not changed much, so it had high genetic stability.Key words: cellulase; solid fermentation; UV mutagenesis; diethyl sulfate mutagenesis目录1 研究背景 (1)1.1引言 (1)1.2 纤维素酶的研究与应用 (1)1.2.1纤维素酶的组成和降解机理 (1)1.2.2 纤维素酶的应用 (1)1.3纤维素酶产生菌筛选法 (2)1.4纤维素酶产生菌的诱变育种 (2)1.5酶活的测定方法 (3)1.6发酵方式 (3)1.7 本文主要研究的意义和内容 (3)2 材料与方法 (4)2.1 材料 (4)2.1.1菌株 (4)2.1.2培养基 (4)2.1.3溶液配方 (4)2.1.4实验主要试剂 (5)2.1.5实验主要仪器 (5)2.2 实验方法 (5)2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制 (5)2.2.2滤纸酶活测量法 (6)2.2.3 硫酸二乙酯（DES）诱变 (6)2.2.4 紫外诱变 (7)2.2.5筛选方法 (7)2.2.6发酵方式 (7)2.2.7发酵条件的优化 (8)2.2.8遗传稳定性试验 (9)2.2.9发酵曲线的制作 (9)3结果与分析 (9)3.1葡萄糖标准曲线 (9)3.2硫酸二乙酯（DES）诱变 (9)3.2.1 DES终浓度的确定 (10)3.2.2 DES诱变时间的确定 (10)3.3紫外诱变 (11)3.4 突变菌的发酵 (12)3.5发酵条件的优化 (12)3.5.1发酵时间对产酶的影响 (13)3.5.2初始pH对产酶的影响 (14)3.5.3种龄对产酶的影响 (14)3.5.4接种量对产酶的影响 (15)3.5.5 C:N对产酶的影响 (16)3.6遗传稳定性 (16)3.7发酵曲线 (17)4 结果与讨论 (17)参考文献 (19)谢辞...................................................................... 错误！未定义书签。
紫外线诱变育种高产纤维素菌
实验方案
诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.
实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：
（1）菌种：木霉单孢子
（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：
紫外线诱变育种
单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）
将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，
同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器
．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算
不同诱变时间的致死率，选择致死率较高的诱变菌液继续检测其产纤维素酶的能力。
致死率(％)=（对照皿的菌落总数-诱变处理后的菌落总数）／对照皿的菌落总数×100
筛选培养基的选择
．．．．．．．．:．挑取孢子接种到PDA 斜面培养基上活化，28℃
培养72h。
通过点样法分别接种于平板筛选培养基1和培养基2 上，28℃培养72h。
观察不同培养基上纤维素酶生产菌的透明圈大小，以确定合适的选择培养基，为进一步筛选做准备.
最佳筛选培养基的确定（对比）
经观察，如果发现平板筛选培养基1 中透明圈较小，平板筛选培养基2（改良培养基）中菌落周围透明圈较明显，因此选择平
板筛选培养基2 作为平板筛选培养基。
复筛：<纤维素酶生产菌菌种复筛> 将纤维素酶生产菌接种于固体曲培养基进行固态发酵，置30℃恒温箱中培养，在12h 以前堆积培养，12h 后摊平，待表面长满菌丝，结成块状时“扣瓶”，继续培养,待长满菌丝即可。
干曲的制备及含水率的测定参考[7]。
测定纤维素酶活力（内切纤维素酶活，滤纸酶活力），筛选高产纤维素酶生产菌.
稳定性试验：对紫外诱变得到的纤维素酶活力相对较高的突变株进行传代遗传稳定性实验, 经一定次数的传代后测定纤维素酶活力.
将所得到的高产纤维素酶菌用于实际生产过程中，与其它产纤维素霉菌对比产酶效率。
注意事项
（1）：用作诱变处理的菌液应尽量使其分散成单细胞，使每个细胞能均匀地接触诱变剂，以避免长出不纯的单菌落。
（2）：照射后的操作都必须在暗室内红光下进行。
