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一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII诱变育种的一般步骤：1.首先是天然菌种的选育：调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离↓原种斜面↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓单株纯种分离生产性能试验→毒性试验菌种鉴定2.诱变菌种：出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。
诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。
在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。
2)挑选优良的出发菌株。
最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。
4)处理单细胞或孢子悬液。
单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。
5)选用合适的诱变剂量。
一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。
6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。
实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
紫外线育种的原理
紫外线育种是指利用紫外线辐射对生物进行基因突变的一种育种方法。
其原理主要包括以下几个方面：
1. DNA损伤和突变：紫外线的能量较高，能够直接与DNA分子发生物理化学反应，如光化学反应和电化学反应。
紫外线辐射能够引发DNA中的嘌呤-嘧啶碱基二聚体的形成，导致DNA链的断裂和碱基的损害。
此外，紫外线还能够引发DNA链中嘌呤碱基的氧化和单碱基突变。
这些DNA的损伤和突变最终会导致基因组的变异和多样性的产生。
2. 后期修复和突变选择：在紫外线照射后，生物体会通过DNA修复机制对DNA 的损伤进行修复。
然而，修复过程可能会引发一些错误，进一步导致DNA序列的变异和突变。
这些突变可能会对生物体的性状产生影响。
在育种过程中，通常会筛选出带有有利基因型突变的个体，通过选择和繁殖这些突变体，从而获得具有所需性状的后代。
3. 增加基因组的多样性：紫外线辐射能够引发大量的基因组突变，包括点突变、小片段的缺失、插入或倒位等。
这些基因组的变异能够增加生物体基因组的多样性，为潜在的有益性状的出现提供可能。
总的来说，紫外线育种利用紫外线辐射引发生物DNA的突变和损伤，进而产生基因组的多样性，通过选择和繁育有利性状的突变体来实现育种目标。
实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1.菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1）菌种：木霉单孢子（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
诱变育种原理
诱变育种原理是指通过人为方式诱发植物或动物的遗传变异，从而产生新的有用基因型和表现型，并将其用于育种改良中的方法。
具体而言，诱变育种原理包括以下几个方面：
1. 辐射诱变：通过辐射（如X射线、γ射线、紫外线等）照射
种子、芽或花粉等植物生殖细胞，使其DNA发生突变。
这些
突变可导致不同表型的出现，包括形态、结构、生理和生化性状等方面的变异。
2. 化学诱变：利用化学物质（如乙烯甲烷、二甲基亚砜、硝酸、硝基尿素等）处理植物，诱发DNA发生突变。
这些化学物质
可干扰 DNA复制和修复过程，导致基因改变。
3. 同源及异源杂交：通过同种植物（同源杂交）或不同种植物（异源杂交）进行杂交，使杂交后代获得来自不同亲本的遗传信息。
异源杂交还可以增加种间杂种的遗传多样性，有利于新品种的选育。
4. 基因工程：利用分子生物学和遗传工程技术，将外源基因导入目标物种或个体中，以实现特定基因型和表现型的引入或改变。
这项技术广泛应用于农业、医学、工业等领域。
诱变育种原理通过引入新的遗传变异，扩大了基因库和表型空间，为育种改良提供了更多的选择。
通过筛选和选择，可以获得更有利于人类需求的植物和动物品种，提高农作物产量、产品质量和抗逆性，推动农业的可持续发展。
微生物的诱变育种一、教学目标及基本要求：1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应；2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。
二、实验原理紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。
紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。
但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。
紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。
本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。
以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。
三、实验材料1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9）3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。
四、方法与步骤1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。
取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。
2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。
3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。
取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。
准紫外线诱变育种1.准紫外线诱变育种备孢子悬浮液取新采收的无菌孢子,放入装有生理盐水的三角瓶中(瓶中可放少量玻璃球),摇荡,使孢子分散.孢子液浓度以每毫升含孢子..诱变处理处理要放在能折光的箱中,箱内顶部装15瓦紫外灯管.把孢子液放在培养皿底部.盖好盖,培养皿距灯管30厘米,处理前先开灯30分钟左右,使波长稳定,然后打开皿盖,照射时间为0.5—4分钟(由于各种菌类的孢子不同,照射时间也应有所不同),选定对孢子杀伤在90﹪--99﹪的适当处理时间.照射结束盖上皿盖,稀释,然后取稀释液0.1毫升涂平板,适温黑暗培养,待长出是芒状菌落后立即挑出,供进一步试验用.(二)硫酸二乙脂诱变处理硫酸二乙酯属烷化剂,对人体有毒,使用时要注意安全.1.准备孢子悬浮液同前2.诱变处理取硫酸二乙酯原液2毫升,加乙醇2毫升溶解,吸取0.4毫升硫酸二乙酯溶液放入20毫升孢子悬浮液中,让其作用.作用时间,至数小时不等,选出孢子杀伤在90﹪以上的适当处理时间,采用大量稀适法中止反复.最后取0.1毫升涂平板或斜面,适温培养,挑出星芒状菌落作进一步试验.(三)单孢杂交方法1.分离单孢采集孢子,采用连续稀释法稀释孢子,以达到镜检每视野1---2个孢子为好;涂布平板,,适温培养;挑起单个菌落,继续培养.2.单核菌丝鉴定(1)海登海因氏铁矾苏木精染色法①苏木精处理:取苏木精0.5克,溶于10毫升95%乙醇内,再加90毫升蒸馏水,用纱布扎住瓶口,置光亮处,3—4个月成熟后方能使用.氧化完成的苏木精呈酒红色.为防止苏木精过度氧化,可将苏木精溶于95%乙醇内配成原液,使用前加水稀释.如在乙醇中加少量甘油效果会更好.②媒染液准备:这种染色法要用铁矾作媒染液.配方为铁矾2.5克,溶于100毫升蒸馏水中即可.③褪色剂制备:将上述媒染液加水稀释一倍即可.④铁矾苏木精染色步骤:将石蜡切片从二甲苯经各级乙醇到水,冲洗,媒染1—4小时,蒸馏水洗2—3次,用退色剂处理至镜检细胞核清晰为止.(2)锁状联合鉴定取菌丝镜检,观察3—5个视野,以找不到锁状联合为准,确认为单核菌丝.(3)出菇试验鉴定利用单核菌丝不结实的特征,相同条件下以双核菌丝作对照鉴定单核菌丝.3.杂交采用两点接种法进行杂交,杂交可在平板上也可在试管内进行.方法是将两个不同亲本的单核菌丝分别接种在平板或试管斜面上,两点相距1厘米左右,适温培养,待两亲本菌丝生长入空白试管斜面,培养.镜检有无锁状联合,如有锁状联合说明已杂交上,留下作出菇筛选.4.初筛,复筛,中试推广取有锁状联合的试管,扩制原种,栽培种,进行小面积出菇筛选,为初筛.把初筛中综合性状表现较好的菌株扩大面积进行复筛,选出优良菌株作中试推广.(四)多孢杂交方法1.亲本孢子萌发时间测试分别制备两亲本孢子悬浮液,同时分别接入培养基上,适温培养,定时观察孢子萌动情况,纪录萌动时间.2.孢子杂交根据亲本孢子萌动时间,同时(孢子萌动时间基本一致)或先后接入孢子液同一试管斜面上,培养,当两亲本菌丝接触,发生自然杂交.培养过程中经常检查,见有单菌落出现就挑出,接入马铃薯葡萄糖培养基上培养.3.拮抗试验取杂交菌株与两亲本作3点拮抗试验,选取有2条拮抗线的菌株扩大培养,作初筛,复筛,中试推广.(五)原生质体融合所谓原生质体是细胞去除细胞壁后的细胞核和细胞质的部分.原生质体融合则是把具有一定遗传标记的两种不同遗传类型的原生质体,通过细胞核和细胞质的融合,进行遗传重组成为新的类型的一种方法.它是生物技术领域的重大突破,它为远缘杂交育种开辟了新的途径.1.原生质体制备(1)培养适龄的菌丝体可以用液体培养,也可用试管斜面培养,一般要求生长旺盛的幼嫩菌丝体.如香菇原生质体制备采用25℃液体培养,也可用试管斜面培养4天的菌丝体最佳.培养基以马铃薯葡萄糖酵母粉培养基为最好,不但菌丝生长不好,同时原生质体释放量有也大.(2)酶系统与酶浓度选择真菌细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和几丁质等多糖物质,合适的脱壁酶系统是这些多糖物质降解的关键,常用的有溶壁酶、脱壁酶、蜗牛酶等.中国科学院广东微生物研究所研制的脱壁酶具有较好的酶解效果,香菇菌丝脱壁采用1%脱壁酶,其原生质释放量可达到10/7%毫升以上 . (3)渗透压稳定剂选择脱去细胞壁的原生质体必须在相应的渗透压条件下才不至于破裂,因此,合适的渗透压稳定剂是影响菌丝释放原生质体的重要因素.常用的有0.6摩/升氯化钾、0.6摩/升硫酸镁及0.6摩/升甘露醇.香菇菌丝脱壁的渗透压稳定剂以0.6摩/升氯化钾或0.6摩/升硫酸镁为宜,原生质释放量均在10/7/毫升以上.(4)酸碱度一般担子菌的脱壁在中性条件下效果最好,香菇则要在较酸[氢离子浓度100微摩/升(PH4)]的酶解反应系统中才能达到高的脱壁率.2.原生质体再生脱壁的原生质体虽然失去原有的形态而变成球形,但细胞质膜和整个基因团仍然存在,它具有原来的生理功能,在适宜的条件下,细胞壁能在形成,恢复为一个细胞,在培养基上形成菌落,这就是再生.再生培养基有麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%(MDY)；麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%,菌丝提取液15%(MDYM);纤维二糖1.5%,蛋白胨0.2%,菌丝提取液20%.香菇原生质体再生方法:将制备好的原生质体经过滤和洗涤后,置于再生培养基MDYM中浅层培养(25℃),2天后把开始萌动的原生质体涂布在固体再生培养基表面,经10至15天后即开始出现微小的再生菌落,把这些菌落转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,10至14天可长满斜面.再生滤可达10%左右,若采用再生培养基MDY,则再生率只有1%左右,说明不同营养成分对原生殖体再生的影响.再在生培养中,渗透压稳定剂以蔗糖为好.3原生质体融合(以香菇为例) 将两个单核亲本的原生质体以1：1混合(每个原生质体数目在5×10/6毫升以上),混匀后缓慢加入等体积的聚乙二醇溶液[ 聚乙二醇溶液4000,30%,10毫摩/升氯化钙 ,氢离子浓度3136纳摩/升(PH5.5)],与24℃静止30分钟,用0.05摩/升甘氨酸,50毫摩/ 升氯化钙,氢离子浓度 0.316纳摩/升(PH9.5)的缓冲液冲洗2至3次,稀释后取0.1毫升放入0.5%软琼脂融合子再生培养基中,混匀后把它薄薄地铺在 1.5%琼脂的融合子再生培养平板上,25℃培养.4. 融合子的检出于鉴定待培养基上出现肉眼可见的微小再生菌落时,将其分别转移到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,镜检菌丝有无锁状联合.融合子的鉴定可做以下试验:镜检有无锁状联合;融合子与亲本菌株的拮抗试验;酯酶同工酶谱;多酚氧化酶谱;DNA扩增仪分析;出菇试验.㈥单核和同核原生质体杂方法由于单核和同和原生质体是直接来源于营养菌丝 ,没有经过减数分裂的无性后代,所以这一材料为食用菌的遗传和育种研究提供了一个十分重要的基础材料.单核和同核原生质体与孢子单核体相比,有它自己的特点:它是自己从菌丝体得到的;只存在两种交配型(亲本型AXBX,AYBY);在菌落形态、菌丝生长速度﹑羧甲基纤维素酶相对活性和酯酶同工酶这4种性状上,都具有相对的稳定性,变异范围小,亲本性状不易在单核原生质体中分散和稀释,这就可以使人们在一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的单核体.单核原生质体的这一特点在食用菌菌种改良中具有重要意义,同时也为遗传育种中充分利用野生种质资源提供了一个十分光明的前景.杂交的具体方法:同前法制备原生质体.分别取不同亲本的单核原生质体进行杂交(杂交方法同单孢杂交),得到杂交株后进行初筛﹑复筛,中试推广.(七)单双核杂交方法选用两个亲本,其中一个用其双核菌丝,另一个分离单核原生质体,在平板上先接种单核原生质体,待菌落长到1厘米左右时,相距0.5∽1厘米处接种双核菌丝,适温培养.数天后,挑取单核菌丝一边.少许菌丝镜检,如有锁状联合,说明已杂交成功,可行扩管培养,进行筛选.四﹑基因工程育种基因工程就是基因水平上的遗传工程.它是用人工方法把人们所需要的某一供体生物的遗传物质---- 脱氧核糖核酸(DNA)大分子提取出来,在离体条件下切割后,把它和作为载体的脱氧核糖核酸分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,以让外来的遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得符合人们预先设计要求的新物种.基因工程主要包括以下步骤︰准备材料,如“目的”基因﹑载体及工具酶等;体外重组;载体传递﹑复制表达.基因工程育种在医﹑工﹑农方面有较多的研究,食用菌育种上研究甚少.。
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选一、目的要求1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料(一) 菌种大肠杆菌(二) 培养基（完全培养基）1. 肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。
如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。
(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。
四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。
取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株一、实验目的1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。
紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。
被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。
同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3.培养基和试剂①无菌水、75%酒精②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～7.0，121℃灭菌20m i n。
④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。
四、实验步骤1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。
加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。
加入无菌水9m L，振荡均匀。
3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30c m）照射0.5-1m i n。
4.取0.1-0.2m L诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。
置37℃暗箱培养48h。
5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值最大者接入斜面保藏。
五、注意事项1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。
故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。
臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。
臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。
六、结果与讨论1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最大者接入斜面保藏?紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
诱变在暗箱中进行。
先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长状况，发现产生了需要的性状后将该植株保留。
注意：前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。
发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。
现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。
只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。
染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。
工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。
发酵时感染杂菌，可引起下列后果：1) 产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；3) 杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；4) 杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；5) 杂菌降解了所需要的产物；6) 发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。
二染菌的检查、原因分析和防治措施1 染菌的检查与判断1) 显微镜检查：通常用革兰氏染色法。
先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。
根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。
必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。
2) 平板划线培养或斜面培养检查法3) 肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
2 发酵染菌率和染菌原因分析发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。
发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。
由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。
3 杂菌污染途径及预防杂菌污染途径及预防1) 种子带菌。
原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。
2) 无菌空气带菌。
杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
3) 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。
原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。
4) 设备渗漏引起染菌。
发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。
5) 操作失误和技术管理不善也会引起染菌。
如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。
对噬菌体的防治措施1) 定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体。
当发酵生产中已经发现了噬菌体的危害后，应立即在车间的各个工段及发酵罐的空气过滤系统、发酵液和排气口、污水排放处以及车间周围的环境中进行取样检测，从中找出噬菌体较集中的地方继而采取相应的措施。
如对种子室和摇床间可采用甲醛熏蒸及紫外线处理的方法消灭噬菌体和杂菌。
对常用器皿及发酵罐体表面，可采用新洁而灭及石炭酸溶液喷雾或擦洗。
发酵系统则可采取改进空气过滤装置和蒸汽灭菌的方法。
2) 检查生产系统，消除各种不安全因素。
在发酵生产中，当连续发生噬菌体污染后，往往在空气过滤装置及发酵罐底部、内壁、夹层以及管道和阀门接口等处容易存在蒸汽不能直接进入灭菌的死角，必须及早查出隐患，定期更换空气过滤器中过滤材料并改进工艺和设备，杜绝发酵液中的活菌和可能存在的噬菌体向周围的环境排放，彻底消除各种不安全因素，保证生产的正常进行。
3) 选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。
选育抗噬菌体菌株是一种有效的手段，所获得的抗性菌株既要有较全面的抗性，并能保持原有的生产能力。
对有的菌种在选育中很难做到既有抗性又能保持原有的生产能力。
在可能情况下，针对噬菌体对侵染寄主具有专一性的特点，采用轮换使用生产菌株的方法，也可防止噬菌体的蔓延和危害，使生产得以正常进行。
4) 应急的挽救措施。
在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确的判断，尽可能快地采取相应的挽救措施。
常用的应急方法有以下几种：①加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。
前者多系螯合剂如草酸及柠檬酸等；后者是一些抗生素，仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。
②当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子（如玉米浆、酵母膏等），有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。
③大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵制终点，防止倒灌，尽可能地减少因噬菌体污染所造成的损失。
在补种之前也可对已感染了噬菌体的的发酵液低温灭菌。
第十一章工业发酵染菌的防治第一节发酵染菌的危害发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。
尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。
所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。
染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。
一，染菌对不同品种发酵的影响青霉素疫苗柠檬酸谷氨酸肌苷、肌苷酸酶制剂二，不同种类的杂菌对发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大三，不同染菌时间对发酵的影响1，种子培养期染菌菌体浓度低、培养基营养丰富2，发酵前期染菌杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成3，发酵中期染菌严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成4，发酵后期染菌如杂菌量不大，可继续发酵。
如污染严重，可采取措施提前放罐四，不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大五，染菌对产物提取和产品质量的影响1，对过滤的影响发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。
造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。
2，对提取的影响（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开（2）离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量3，对产品质量的影响（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。
