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植物基因组DNA的提取及分析一、植物基因组DNA提取的步骤：1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。
样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。
2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。
3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。
4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。
加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。
5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。
静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。
6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。
7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。
二、植物基因组DNA分析的方法：1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA 序列。
首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。
电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。
3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA 片段进行电泳分析。
根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA 的分析和比较。
4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。
通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。
5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。
通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。
植物基因组dna的提取实验报告植物基因组DNA的提取实验报告。
植物基因组DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，本实验旨在通过提取植物细胞中的DNA，为后续的PCR扩增、基因克隆、基因组测序等实验打下基础。
本报告将详细介绍植物基因组DNA提取的实验步骤、方法和结果。
实验材料和仪器。
1. 实验材料，植物叶片样品、液氮、细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、异丙醇、等离子体膜、异丙醇沉淀液、乙醇、夹板、离心管、PCR管等。
2. 实验仪器，搅拌器、冰箱、冷冻离心机、显微镜、紫外可见分光光度计等。
实验步骤。
1. 取少量植物叶片样品置于液氮中，研磨成细碎的粉末状。
2. 将研磨好的植物叶片样品加入细胞裂解缓冲液，混合均匀后浸泡于65°C水浴中。
3. 加入蛋白酶K，继续65°C水浴裂解。
4. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃离心管，使溶液混合均匀后放置于室温。
5. 加入等体积的等离子体膜，轻轻摇晃离心管，使溶液混合均匀后放置于室温。
6. 加入等体积的异丙醇沉淀液，轻轻摇晃离心管，使溶液混合均匀后放置于室温。
7. 将混合液转移至PCR管中，加入等体积的乙醇，轻轻摇晃离心管，使溶液混合均匀后放置于室温。
8. 离心沉淀后，弃上清液，加入70%乙醇洗涤。
9. 将洗涤后的DNA溶解于TE缓冲液中，用紫外可见分光光度计检测DNA浓度和纯度。
实验结果。
通过上述步骤，成功提取了植物基因组DNA，并进行了浓度和纯度的检测。
实验结果显示，提取的DNA浓度为120 ng/μl，纯度（A260/A280）为1.8，符合后续实验的要求。
结论。
本实验通过简单、快速、高效的方法成功提取了植物基因组DNA，为后续的分子生物学实验提供了可靠的基础。
通过本实验，我们对植物基因组DNA的提取过程有了更深入的了解，为今后的科研工作积累了宝贵的经验。
总结。
植物基因组DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，本实验通过简单、快速、高效的方法成功提取了植物基因组DNA，并进行了浓度和纯度的检测。
4 种快速植物基因组DNA 提取方法比较：DNA 是从2 周龄水稻幼苗中提取。
（1）煮沸法：取50 mg 新鲜水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μLTE Buffer，用细玻璃棒捣碎混匀；在沸水上煮10 min，冰浴10 min；于室温下13000 r/min 离心5 min；将上清储存在-20 ℃中。
（2）微波炉法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；在700 W 家用微波炉中高热处理5 min，加入100 μL TE Buffer，振荡，13000 r/min离心 5 min；将上清液储存在－20℃。
（3）碱处理法：取50 mg 水稻叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入配好的NaOH 提取液[(Tris-HCL) = 100 mmol/L (pH8.0)，c(NaOH) =300 mmol/L(TritonX-100)=0.3 %]用玻璃棒捣碎混匀，室温静置片刻后13000 r/min 离心3min。
4）TritonX-100 提取法：取50 mg 嫩叶片，剪碎至一干净1.5 mL 离心管中；加入200 μL 提取缓冲液[c (Tris-HCl) = 20 mmol/L (pH8.0)，c (EDTA) =2mmol/L，c (TritonX-100) = 1.2 %]用细玻璃棒捣碎混匀；65 ℃水浴15 min，13000r/min 离心5 min，将上清储存在－20 ℃。
每个方法做三次重复，分别用上清提取液进行电泳检测。
将提取所得的基因组DNA 用 1.5 %琼脂糖电泳分析，结果表明用试剂盒提取的基因组DNA 最完整，Triton X-100 提取法所得的基因组DNA 条带也较明亮，煮沸法、微波法和碱处理法没有基因组条带。
LAMP检测结果：碱处理法和微波处理法扩增出来的条带亮度低，可能是因为微波和碱破坏了基因组的完整性。
煮沸法和Triton X-100 提取法的检测效果最好，这与提取液的成分能很好的保护基因组的完整性有关，可用于现场LAMP 检测用模板DNA的快速制备。
生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日题目：植物基因组DNA的提取与检测一．实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。
二．实验原理1.液氮研磨：液氮能迅速将植物组织温度降到零度以下，使组织细胞变得脆而易碎，此时对植物组织进行研磨，能大大提高研磨的效率，植物组织迅速变为粉末状，增大表面积，提高提取植物DNA的效率。
2.SDS等离子型表面活性剂处理：SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来，且使DNA保持溶解溶液状态，易于分离3.苯酚和氯仿处理：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.异丙醇处理：上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，离心后DNA沉淀于离心管底部，便于移去提取液。
而后将沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶液；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
三．实验材料及设备1.实验材料：新鲜的植物幼嫩叶片2.实验仪器：（1）研磨皿，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。
3.实验试剂：（1）植物DNA提取a.细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）；b.氯仿:异戊醇（24:1）；c.其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液；作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。
植物基因组D NA 提取2ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片；2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 µL CTAB 缓冲液；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下；5. 加入900 µL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿充分混合；6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟；7. 取上清液约800 µL，加入预先加好的700 µL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻轻上下颠倒混匀；8. -20℃冰箱静止30 分钟以上；9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜；10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟；11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；12. 加入100 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA；14. 取2 µL DNA 进行检测。
50ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末；2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓冲液充分混匀；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 取出，冷却至15 ℃以下；5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿充分混合；6. 4500rpm 离心40 分钟；（如不需要抽提第2次，可直接到9步骤）7. 小心吸取上清液至新的50ml 离心管中，加入20ml 的氯仿溶液，混匀2-5min左右8. 4500rpm 离心40 分钟；9. 取上清液于50ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，此时会看到絮状沉淀；10. -20℃冰箱静止30min 以上；11. 4500rpm 离心40min，弃上清夜；12. 加入5ml 的75%酒精洗涤沉淀，4500 rpm 离心30min，弃上清液；13. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；14. 加入约300 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；15. 放入37 ℃环境中，约60min 消化R NA；16. 取2 µL DNA 进行检测。
植物基因组DNA快速提取方法
步骤：
1.向无菌的1.5ml的EP管中加入400ul 的DNA提取液；
2.用小剪刀剪取少许（肉眼可见即可）拟南芥幼嫩叶片于上述1.5ml
的EP管中（为了防止DNA交叉污染，剪取一片拟南芥组织后需将剪刀用卫生纸擦干净）；
3.用无菌的研磨棒将1.5ml的EP管中的叶片研磨至无可见叶片颗粒；
4.12000 RPM室温离心5分钟后取上清液于新的1.5ml的EP管中；
5.向上述EP管中加入400ul的异丙醇轻轻混匀后，室温静止10分
钟；
6.12000 RPM室温离心10分钟后弃上清，并加入400ul的70%的乙
醇；
7.混匀后12000 RPM室温离心5分钟后弃上清，将EP管置于37度
培养箱大约10分钟（晾干酒精）；
8.晾干后加入50ul的无菌水溶解基因组DNA;
9.去上述提取好的基因组DNA大约2ul作为模板即可进行后续的
PCR反应；
所需仪器：离心机，1ml和200ul移液枪，无菌研磨棒，无菌的1.5ml 的EP管；卫生纸；
溶液配制：
DNA提取液（500ml）（可长期室温保存）
200mM的Tris盐酸加入100ml 1M 的Tris盐酸存储液（PH：8.0）250mM的NaCl加入25ml 5M的NaCl存储液
25mM的EDTA 加入25ml 的0.5M的EDTA存储液
0.5%的SDS 加入12.5ml的20%的SDS存储液。
CTAB法提取植物基因组DNA原理这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。
(1) 2×CTAB溶液CTAB（W/V）2%Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）EDTA 20mmol/L （pH8.0）NaCl 1.4mol/LPVP 1%灭菌备用。
没灭菌前呈粘稠状，CTAB灭菌后变成清亮的溶液。
(2) 氯仿/异戊醇（24:1）(3) RNaseA 10mg/ml(不用)(4)乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇(6) 70%乙醇操作程序⏹1．在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB, 65℃预热，用前加入20 μl β-巯基乙醇。
⏹2．嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。
⏹注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。
而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。
⏹3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。
4．加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min 或-80℃放置10min ，12 000rpm 离心10-15min 回收DNA 沉淀。
⏹ 5．用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O 或TE 缓冲液中⏹ 6．0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的完整性。
植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。
3 取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯仿/异戊醇。
充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。
1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。
6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。
待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。
植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。
2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。
3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。
4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。
5 加入4ｍｌ氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。
6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。
植物基因组dna的提取实验报告
实验报告：
实验目的：
本实验旨在从植物样品中提取基因组DNA，为后续的分子生物学研究打下基础。
实验原理：
基因组DNA提取是利用化学或物理方法将细胞壁和细胞膜溶解，使基因组DNA裸露并获得。
提取过程包括浸泡、分离、洗涤、溶解等步骤。
具体步骤如下：
取所需植物材料，洗净、切碎样品；
加入提取缓冲液（Tris-HCl pH 8.0，EDTA，SDS，NaCl），使样品充分混合，破坏细胞膜和核膜；
加入蛋白酶K，分解蛋白质，避免DNA被酶水解；
加入异丙醇或氯仿使蛋白质、核酸等组分分层，去除上层杂质；
加入70%乙醇将DNA沉淀，并进行清洗和干燥；
加入TE缓冲液（Tris-HCl pH 8.0, EDTA）溶解DNA。
实验步骤：
取植物样品（番茄、酸枣等）粉碎，加入4ml提取缓冲液，放入离心管中；
加入1μl蛋白酶K，轻轻颠倒离心管使样品混合均匀；
培养30分钟于65°C恒温器内；
加入1ml氯仿并振荡10次后，离心5分钟，将上层液体转移至新的离心管中；
加入1ml异丙醇，并离心5分钟，将上层液体转移至新的离心管中；
加入1ml70%乙醇，并离心5分钟，将上层液体倒掉，留下沉淀；
加入1ml去离子水，将沉淀溶解，得到DNA提取液。
实验结果：
经过以上步骤，成功从植物样品中提取到基因组DNA。
通过分光光度法检测DNA浓度为200 ng/μl，纯度可达到A260/A280=1.8。
结论：
本实验成功从植物样品中提取到基因组DNA，提取效果良好，为后续的分子生物学实验打下基础。
景天科植物基因组D N A的高效提取方法赵为,邓科君,杨足君*,周建平,任正隆(电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都610054)摘要采用C T AB法,低浓度的乙醇与N aC l沉淀D N A,再用正丁醇进一步萃取多糖,建立了景天科特种植物的D NA提取方法,获得的D N A经琼脂糖电泳和紫外分析仪检测,浓度和质量均较高。
用线粒体n ad7基因的特异引物对该法提取的大花红景天D N A进行扩增,获得了长为791bp片段的目标序列。
结果表明:该法有利于去除景天科植物材料中多糖、多酚类和RN A等物质,获得的高质量基因组D N A 完全可以满足各种分子生物学研究的要求。
关键词景天科植物;D N A提取;N ad7基因中图分类号Q781文献标识码 A 文章编号0517-6611(2006)22-5804-02A n E ffe c t iv e M e th o d o f D NA E x tra c t ion fromCra s su la c e a e P la n tZHAO W e i e t a l(C o lle ge o f L ife S cien ce an d T ech n o log y,U n iv er sity o f E le ctron ic S cien ce an d T ech n o log y,C h en gdu,S ichu an610054)A b s tra c t A n e ffectiv e m e th od fo r ex tractin g D NAfro mspecia l crassu la ceae p lan ts w as con s tru cted by ba sic C T AB m e th od fo llow ed by low con cen tra ted e th an o l an d N aC l,a s w e ll a s th e am y lose rem oved by bu tan o l.H igh con cen tra tion an d good pu r ityD NA w as ob ta in ed a fte r m easu red by U V spe ctroph o-to m e te r an d a ga rose ge1e lectroph ore sis.A P CR am plifica tion by m itoch on dr ia l N ad7g en e con se rved p ri m e r pa ir w as car ried ou t u sin gth e iso la ted R h od io la crenu la te D N A an d a targ e t791bp ban d w a s p rodu ced.T h e resu lts in d ica ted th a t th e p resen t D N Aiso la tion m e th od w as e fficien t to rem ove th e po lyph e-n o l,am y la se and RN A con tam in a tion,an d g en era te a h igh qu a lity gen om ic D N A,w h ich w ou ld m ee t th e n eeds o f th e fo llow in g m o lecu la r b io log ica l an a ly-sis.K e y w o rd s C rassu laceae;D N A ex traction;N ad7gen e核酸是构成生物体中基本遗传物质的主要化合物。
从核酸分子水平系统、深入地研究是认识各种生命现象的基础,而提取出高质量的DN A是开展这些研究的前提。
目前对动物、植物和微生物的DNA提取研究相当多,但是由于物种之间的差异,DNA提取方法各有不同[1-5]。
特别是对于一些次生代谢产物含量高的特异遗传资源,较难获得高质量DN A已成为其开展分子水平研究的限制因素。
景天科植物为双子叶植物,35属,1600种,广泛分布于全球,主产地为南非。
我国约有景天科植物10属,247种,全国各地都有分布[6]。
景天科植物是多年生的肉质植物,外形美观,大量作为观赏植物;同时,也有部分植物作为药用植物,比如红景天(Rhodiola L.)属中的唐古特红景天(R. t angu tica)、大花红景天(R.crenu la te)(藏名均叫“苏曼玛保”)、小丛红景天(R.dum u lo sa)及狭叶红景天(R.k irilow ii var.l atifoli a)(藏名“尕都尔”),有活血止血、化瘀消肿之功效,治疗跌打损伤、吐血衄血咳血、月经不调及痢疾等,在藏族医药中将其花、根入药,主治肺病、神经麻痹症等[7]。
目前针对景天科植物的DN A提取研究十分缺乏。
为此,该文利用珍贵藏药红景天和观赏用的景天科植物为材料,建立了一种经济高效的DN A提取方法,并对获得的DN A 开展了PCR克隆测序鉴定。
1材料与方法1.1植物材料大花红景天(R.crenu l ate)、长鞭红景天(R. fas ti g i at a)、高山红景天(R.sacha lin en sis)采自四川省甘孜藏族自治州;景天科的观赏植物观音座莲(A rchang iop teris h en ry-i)、红石莲(E ch everia clegan s)、红花莲(E cheveria ca rn ico lo r)、大玉珠帘、小玉珠帘(S edum m organ ian um)购买于成都市花市。
1.2主要试剂DN A提取液为2%C T AB、1.4m o l/L N aC l、基金项目教育部春晖计划项目(Z2004251008)。
作者简介赵为(1985-),男,四川成都人,本科生,专业:药用植物生物技术。
*通讯作者。
收稿日期2006-07-1720m m o l/L ED T A(pH8.0)、100m m ol/L T ris-H C l(pH8.0)、2%β-巯基乙醇;氯仿/异戊醇(24∶1),氯仿,无水乙醇,0.3m o l/L N aC l,正丁醇。
1.3 DNA提取方法取新鲜植物材料0.2～0.3g,在液氮中研磨成粉并快速转移到1.5m l离心管中,加入60℃预热的DN A提取液1m l,剧烈振荡,混匀,60℃水浴40m in,其间轻柔混匀1～2次;加入2/3体积的氯仿/异戊醇(24∶1),10000 r/m in离心5m in,取上清液置于另一个离心管中,再加入等体积的氯仿抽提,11000r/m in离心10m in,取出上清液加入等体积的无水乙醇沉淀,冰上放置30m in,13000r/m in离心15 m in,小心去掉上清液,用70%的酒精润洗2次,晾干,溶于300μl TE中,加入50μl的RN a se。
待溶解后加入0.3m o l/L N aC l1m l,等体积的无水乙醇沉淀,冰上放置20m in,13000 r/m in离心15m in,倒掉上清液,加入2m l正丁醇,55℃水浴10 m in,小心去掉上清液,沉淀用70%酒精润洗2次,晾干,溶于250μl TE中,-20℃保存,备用。
1.4 DNA纯度鉴定取提取的DN A样品5μl,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,同时用岛津核酸蛋白测定仪进行测定。
1.5 PCR分析用线粒体基因nad7内含子2的特异引物对所提取的DN A进行PC R扩增,引物序列为nad7-2F,5’-GA TT-T A CC T TA TTC TGA TCG-3’;n ad7-3R,5’-TGT TC TTGGGC CA T-CA T AGA-3’[7]。
PCR扩增反应体系为25μl,包括10×PCR B u ffe r2.5μl,25m m o l/l M gC l21.5μl,10μm o l/l引物各1μl, 2m m o l/l dN TP1μl,ddH2O15.7μl,5U/μl T a g酶0.3μl和模板DN A2μl,最后加入一小滴矿物油。
扩增反应在B I O-RAD公司生产的M yC ycle TM T h erm a l C y cle r中进行,94℃预变性3m in;然后,94℃变性1m in,55℃复性1m in,72℃延伸2m in,42个循环;最后,72℃延伸10m in。
扩增产物用1%琼脂糖胶电泳分离,在GD S-G e l D o l2000凝胶成像系统下扫描照相。
1.6 PCR扩增片段克隆测序将PCR扩增产物从琼脂糖胶中回收,将回收的DN A与pM D18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,并挑取阳性克隆送交北京三博远志生物公司进行测序。
DN A序列分析运用了DN AM AN软件和安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2006,34(22):5804-5805责任编辑刘月娟责任校对孙能森G enebank 中的N C B I B LA S T 服务程序。
2 结果与分析2.1 提取DNA 的纯度 通过1%琼脂糖凝胶电泳分析所获得的全部样品DN A 均为单一条带,无降解的DN A 片段。
用岛津核酸蛋白测定仪测定提取样品DNA 的A 260/A 280值,结果见表1。
表1表明,所得的A 260/A 280值均高于1.8,说明该方法提取的DN A 具有较高的纯度。
表1提取DNA 的测定结果材料名A 260/A 280浓度∥μg/μl 1大花红景天 2.066 1.562长鞭红景天 2.0007.763观音座莲 2.053 5.464红石莲 2.0657.515红花莲 2.0229.066大玉珠帘 2.039 3.197小玉珠帘 2.010 6.178高山红景天2.1546.242.2 PCR 分析 根据文献报道设计了n ad7内含子2引物,对供试材料进行DN A 扩增。
从图1可以看出,以上述方法提取的DN A 为模板,从红景天属植物中扩增出了一条约700bp 的清晰条带,从观赏的景天科植物中扩增出了约1000bp的清晰条带。
注:1～7材料序号同表1。
图1 景天科几种植物D NA 基因组n a d 7内含子2的PCR 扩增注:箭头之内为内含子。
图2 大花红景天N a d 7内含子2的核苷酸序列2.3 序列分析 对大花红景天的PCR 产物进行回收、克隆和测序,得到了长度为791bp 的序列,序列见图2,登录N CB I ,获得G enb ank 号为DQ 508743。
