细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。

（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。

（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。

（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。

吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。

（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。

1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。

（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。

（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。

（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。

紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。

1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。

将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。

然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。

在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。

1000rpm, 离心3分钟。

弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。

此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。

贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。

可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。

首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。

细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。

而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。

一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。

最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。

背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：/yp/product-list-42.html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：/yp/product-list-43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。

（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。

（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。

2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。

生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。

吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。

反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。

进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。

（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。

细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。

注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。

降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。

三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。

（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

. 细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

（二）细胞传代培养具体操作1、细胞：贴壁细胞株2、操作步骤1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。

随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。

观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。

一般室温消化时间约为1-3分钟。

4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。

第二天观察贴壁生长情况。

细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。

3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。

吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。

4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。

5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。

-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。

实验一、冻存细胞的复苏与传代培养（9学时）一、清洗与灭菌（一）实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

（二）实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。

体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。

细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。

清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。

如有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。

灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。

假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。

以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。

（三）仪器、材料和试剂仪器超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。

材料无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25 mm）：孔径为0.22μm，微孔滤膜（直径90 mm）：孔径为0.22μm，过滤器（直径25 mm）。

试剂（参见附录4）70%或75%酒精，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液（来苏儿水），0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸（工业），DEPC水[体积分数0.1%的碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）]。

（四）实验步骤清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。

2．使用过的玻璃器皿的清洗（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。

（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。

（3）浸酸性洗液过夜。

（4）从酸性洗液捞出后用自来水冲洗10～15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。

（5）包装（牛皮纸或一般纸）。

（6）高压（15磅20min）或干热（160℃ 2h）灭菌（见（二）消毒与灭菌）。

细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。

②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。

二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。

其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。

细胞传代冻存复苏步骤1.细胞培养首先，需要从细胞库中取出要冻存的细胞，并将其接种在适当的培养基上。

培养基应该包含适当的营养物质和生长因子，以确保细胞的正常生长和分裂。

2.细胞生长将培养皿置于恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和气体环境。

细胞需要在培养基中适当的时间内生长和扩增。

通常，培养时间为2-3天，视细胞类型而定。

3.细胞检查在细胞生长期间，必须定期对细胞进行检查，以确保其健康和无污染。

细胞检查可通过显微镜观察细胞形态和活力，或通过细胞培养基中的染料检测细胞活性。

4.细胞分离一旦细胞达到所需的数量，即可进行细胞分离。

使用适当的胰蛋白酶或其他消化酶来分离细胞。

细胞分离后，将其转移至新的培养皿中。

5.细胞计数使用血细胞计数板或其他形式的计数器来计数细胞数目。

细胞计数是决定细胞数量和密度的重要步骤，以确保在冻存过程中使用适当的细胞浓度。

6.冻存液制备冻存液是保护细胞冻存过程中的关键溶液。

常见的冻存液成分包括培养基和甘油、DMSO（二甲基亚砜）等保护剂。

这些成分具有保护细胞免受冻结和解冻过程中的损伤的作用。

7.细胞冻存将细胞和冻存液混合在一起，使用冷冻管或冻存管将其分装。

然后将冻存管放入冷冻容器中，使其逐渐冷却至极低温（通常为-80℃或液氮温度）。

8.细胞解冻在需要复苏细胞时，从冷冻容器中取出冻存管，快速解冻至37℃。

解冻时应非常小心，以免损伤或破坏细胞。

可选择将冻存管置于37℃水浴中解冻，或使用预先加热的介质进行解冻。

9.细胞复苏一旦细胞完全解冻，将其迅速转移到预先准备好的培养皿中。

加入适量的培养基和生长因子，为细胞提供所需的营养和环境条件。

将培养皿放入恒温培养箱中，并维持适当的生长条件。

10.细胞生长观察在细胞复苏后，定期观察细胞的生长和活性。

使用显微镜观察细胞形态和增殖情况，确保细胞正常生长。

如果发现任何细胞死亡或异常现象，可能需要采取相应的措施来解决。

11.细胞传代一旦细胞复苏并正常生长，可以进行细胞传代以扩增细胞数量。

一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。

二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。

2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。

3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。

4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。

（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。

3.离心，1 000 rpm，5 min。

4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。

四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。

一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。

二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

细胞复苏及传代操作方法
细胞复苏和传代是细胞实验室中常用的实验技术，用于维持和增殖细胞系。

细胞复苏方法：
1. 从冻存细胞库中取出冻存细胞，并将其快速解冻。

可以使用热水浴或速溶法进行解冻。

2. 解冻后，将细胞迅速转移到预先准备好的培养基中。

培养基应包含适当的营养物质和生长因子，以支持细胞复苏和增殖。

3. 将细胞培养在恒温培养箱中，通常在37摄氏度、5% CO2下培养。

4. 定期观察细胞的形态和增殖情况，确定细胞已成功复苏。

传代操作方法：
1. 当细胞达到足够的密度和数量时，用胰酶/胆碱盐溶液或丝裂霉素等方法将细胞从培养器表面剥离。

2. 将细胞转移至新的预先准备好的培养器中，添加新的培养基，以稀释细胞并提供新的营养物质。

3. 培养细胞在恒温培养箱中继续生长和增殖。

4. 定期观察细胞的形态和增殖情况，重复传代操作直到需要的细胞数目达到或超过所需的实验要求。

细胞复苏和传代操作需要严格的无菌操作和细胞培养条件，确保细胞的健康和纯度。

在进行这些操作之前，应进行充分的培训，并遵循实验室的安全操作规程。

细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。

细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。

4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。

细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。

2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。

3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。

细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

MSC细胞复苏、传代及冻存操作步骤MSCs不仅可以下调免疫应答强度以调节机体的先天性免疫与适应性免疫，⽽且还可以促进⾎管⽣成、抑制细胞凋亡。

近⼏年，MSCs已然成为⽣命科学研究的热点之⼀。

然⽽，MSC细胞的培养却⾮易事，成功建⽴可靠的MSC细胞培养操作体系往往需要处理好各种操作细节。

对脐带分离MSC细胞的实操感兴趣的朋友，可以点击链接：历史⽂章-脐带分离原代MSC细胞操作步骤MSC细胞复苏1、仪器设备、耗材及试剂仪器设备：超净⼯作台⼀台、⼆氧化碳培养箱⼀台、⽔浴锅⼀台、低温离⼼机⼀台、显微镜⼀台、1mL电动移液枪、电动移液器。

耗材：镊⼦、15mL离⼼管、细胞培养瓶、10mL移液管。

试剂：MSC培养基础培养基、MSC培养完全培养基、台盼蓝染⾊液。

2、细胞复苏操作步骤实验前准备细胞培养基置于4℃平衡，⽔浴锅预先调⾄37℃，离⼼机开机预冷⾄4℃。

细胞复苏a. 从液氮罐中取出冻存管，如有液氮渗漏进冻存管内，先稍微拧松管盖，让⽓化的液氮逃逸（否则冻存管有爆炸危险）。

b. ⽤镊⼦夹住冻存管，浸⼊37℃温⽔中（注意管⼝不要浸⼊液⾯以下），并不时摇动，待管中冰核溶解⾄黄⾖粒⼤⼩时拿出，酒精擦拭后转移⾄超净⼯作台内。

注：该步骤对细胞存活率⾄关重要，既要尽快融化，减少融化过程对细胞的损害，⼜要尽可能减少细胞在较⾼温度停留的时间，以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在⽔浴锅中不管。

c. 将冻存管内细胞悬液（约1mL）转移⾄装有（约14ml）4℃预冷MSC培养基础培养基的15mL 离⼼管中，上下颠倒混匀（所有操作轻柔缓慢，以防损伤细胞）。

d. 4℃，210g，离⼼4min，吸去上清液，加⼊1mL MSC培养完全培养基重悬混匀。

e. 取出10uL细胞悬液⽤PBS稀释⼀定的倍数，取10µL稀释后的细胞悬液加⼊台盼蓝染⾊液，显微镜下计数；根据计数结果及所使⽤培养基推荐的接种密度（如使⽤达优GF20培养基，推荐接种密度4000-5000个cells/cm2）计算所需细胞悬液体积。

细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。

细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。

细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。

本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。

细胞冻存篇冻存原则细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。

如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。

在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。

DMSO使用注意事项DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。

程序冻存液配方程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。

血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。

根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。

细胞冻存密度细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。

提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。

冻存操作方法方法一：使用程序冻存盒使用程序降温盒是最常用的冻存方法。

市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。

降温盒须恢复室温后再使用。

根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。

操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存▲ 使用冻存盒操作示意图方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。

一、目的：掌握将冻存良好的细胞复苏、培养的基本原理与方法。

二、原理：细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

三、步骤：（一）材料准备：1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置显微镜、培养箱、微量加样器。

2. 耗材：枪头、培养皿、15ml离心管、酒精灯、废液缸。

3. 试剂：培养基、血清、双抗（青霉素、链霉素）。

4. 其他物品：记号笔、记号笔、橡胶手套、口罩、100%和75%酒精。

（二）细胞复苏步骤：1.从液氮或-80℃冰箱容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，于超净台中打开盖子，用枪头吸出细胞悬液，加到15ml离心管中（离心管中已预先加入了3ml细胞完全培养基），轻弹混匀。

3.离心，1 000 rpm，5 min。

4.弃去上清液，轻轻敲打重悬细胞，加入含10%FBS的细胞培养基，轻弹重悬细胞，调整细胞密度，接种培养皿，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。

四、注意事项：1．拿出冻存的细胞后，尽快置于37℃水浴中融化，整个复苏过程要快；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．细胞轻弹混匀，勿反复多次吹打。

一、目的：学习细胞传代培养的原理及一般方法，熟悉传代培养的操作步骤以及进一步掌握无菌操作技术。

二、原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2 或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞传代冻存的原理
细胞传代冻存是一种用于保存细胞的技术，它能够让细胞在低温条件下存活，并在需要的时候重新激活。

这项技术对于研究和应用领域来说具有重要意义，可以帮助科学家们长期保存和研究各种细胞，并在需要时进行复苏和使用。

细胞传代冻存的原理相对简单，但却非常有效。

首先，需要选择一个适合的冻存液。

常用的冻存液包括甘油、二甲基亚砜和胎牛血清等，这些液体可以保护细胞免受低温冻结的损伤。

接下来，将细胞培养物中的细胞进行收割，并加入冻存液中。

冻存液中的化学成分可以防止细胞受冻结过程中产生的压力和损伤。

然后，将细胞和冻存液混合均匀，并分装到冷冻管中。

在分装完成后，冷冻管需要迅速被放置在低温环境中，通常是液氮中。

液氮的温度极低，可以迅速冷冻细胞，防止冷冻过程中产生的结晶对细胞造成损伤。

此外，液氮也能够提供足够的低温，保证细胞在冻存过程中能够长时间保存。

当需要使用冻存的细胞时，可以将冻存管迅速取出，并迅速解冻。

解冻的过程需要遵循一定的步骤，以最大限度地减少细胞受损。

一般来说，解冻的过程需要将冻存管放在37摄氏度的水浴中，直到细胞完全解冻为止。

解冻后的细胞可以用于各种实验和应用，比如细胞培养、生物学研
究和药物筛选等。

通过细胞传代冻存技术，细胞可以长期保存，大大方便了科研工作者的工作。

细胞传代冻存技术的发展给科学研究和应用带来了许多便利。

通过这项技术，科学家们可以更好地保存和利用各种细胞资源，为科学研究和药物开发提供了重要的支持。

相信随着技术的不断进步，细胞传代冻存技术将在未来发挥更加重要的作用，为人类的健康和科学发展做出更大的贡献。

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。

倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。

7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。

总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。

2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。

3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。

另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。

4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。

实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。