细胞复苏传代冻存过程

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。

第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。

第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。

第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。

确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。

第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。

培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。

细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。

细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。

第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。

定期检查细胞的形态和生长状态。

第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。

确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。

第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。

冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。

细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。

细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。

降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。

第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。

定期检查液氮罐的液位和温度。

第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。

检查培养箱、显微镜等设备是否正常。

第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。

快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。

细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。

离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。

细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。

复苏293细胞
1.紫外消毒超净台，完全培养基（10％FBS）复温，准备一个15ml离心管；
2.从液氮（-198℃）中取出293细胞，在37℃水浴锅解冻；
3.取10ml完全培养基于15ml离心管，加1.5ml冻存293细胞，轻轻混匀；
4.离心1500rpm，3min；
5.吸走上清，混匀后加5ml完全培养基；
6.吹打混匀后转入培养瓶培养。

293细胞传代
1.293细胞长到70％即可传代，将培养皿边缘用酒精棉球擦一遍；
2.负压吸走培养基，加PBS 洗一遍；
3.负压吸走PBS，加胰酶（没过皿底即可）消化；
4.负压吸走胰酶，加两吸管培养基，将细胞从皿底吹落；
5.对准皿底用力吹打10下，将细胞吹散；
6.将吹散细胞加入培养基内，摇匀；
7.种细胞，6孔板每孔加2ml（用于转染的板需先用Polylysine扩板），放回孵
箱培养。

冻存293细胞
1.当293细胞长到70％时，准备冻存；
2.冻存液：90％完全培养基，10％DMSO （根据说明书要求配制，不同种类
293冻存液不同）；
3.吸干培养基，用PBS洗一遍；
4.加入胰酶消化后，吸去胰酶，加入少许培养基吹打；
5.转入15ml离心管，加培养基至10ml并混匀；
6.离心1500rpm，3min；
7.吸去上清，沉淀加冻存液吹打混匀（根据要冻存的细胞的多少加适当量的冻
存液，冻存细胞浓度不宜过稀，一个25cm2培养瓶冻2-3管）；
8.分装至冻存管，每管约1.5ml；
9.将冻存管放入异丙醇盒并置于-80℃过夜;
10.然后将冻存管放入液氮储存。

一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。

紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。

1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。

将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。

然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。

在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。

1000rpm, 离心3分钟。

弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。

此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。

贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。

在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。

然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。

第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。

2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25 瓶为类；1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。

加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。

记录冻存管位置以便下次拿取。

准备处事：之阳早格格创做1、加进细胞室前，最先用75%酒粗揩试处事台，交着紫中灭菌30-50min，过后，关关紫中灯，透气10min.2、从冰箱中与出胰酶、PBS缓冲液、培植基注意事项：1、所有真验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘搞.2、挨开溶剂，培植瓶瓶盖时，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下.3、用完溶剂，培植瓶时，瓶心及瓶盖也要正在酒粗灯上烤一下.开初处事：1、真验前易服帽，开风淋，吹风.2、75%乙醇揩脚，而后用75%乙醇揩一下台里，面焚酒粗灯.3、与待用的细胞，旋紧瓶盖.4、弃去旧的培植液，把培植瓶搁回本处.5、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.而后将PBS缓冲液弃掉.7、用移液管（微量枪）吸与适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头.8、将细胞置于5%CO2、37度培植箱中1min-2min，脚段：普及酶活性，促进消化.9、与待用细胞，与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.10、用移液管加进适量的真足培植液浑洗（吹集细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹集下去，再将细胞悬液移进的离心管中，启心，标签.11、离心5min，1000转/min.以下分别介绍：一换液1、与待用的细胞，旋紧瓶盖.2、弃去旧的培植液，把培植瓶搁回本处.3、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.而后将PBS缓冲液弃掉.5、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.6、用移液管加进适量的细胞培植液于培植瓶中.7、将细胞置于5%CO2、37度培植箱培植.两传代1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液，吸与已配造的培植基适量，加进离心管中，将细胞沉悬、吹匀.2、与4-6滴细胞悬液到新的培植瓶中，培植瓶中应先加佳适量细胞培植液，吹集细胞，镜下瞅察，细胞稀度相宜则置进5%CO2、37度细胞培植箱中.三冻存1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液.2、按胎牛血浑：DMSO=9:1的比率配造冻存液，拆进青霉素瓶中.3、用移液管将冻存液仄衡加进离心管中，混匀离心管中细胞冻存液.4、用移液管将含细胞的冻存液移进冻存管中，启心，标签.5、冻存，需缓缓冻存，先搁置4度冰箱1小时，而后搁置-20度冰箱2小时，再置于-80度冰箱过夜，终尾置于液氮灌中保存.四种板1、细胞离心毕，拆启，瓶心及瓶盖正在酒粗灯上烤一下，弃去上浑液.2、与培植瓶及小烧杯各一只，摆搁佳.3、与移液管一支，塞棉花端，及管身，均正在酒粗灯上烤一下，套佳吸球.4、先移与2ml，5ml，20ml真足培植液,分别加进到离心管，培植瓶，小烧杯中.5、混匀离心管中含真足培植液的细胞，再从离心管中与适量细胞悬液移进培植瓶，吹集细胞.镜下瞅察，细胞稀度相宜则置进5%CO2、37度细胞培植箱中.（细胞传代脚段）6、与细胞计数板，盖玻片酒粗揩拭，均正在酒粗灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中与出细胞悬液（约10μl），弃掉枪头，滴进盖玻片下（没有克没有及有气泡，可则会做用细胞计数），镜下瞅察细胞数（每个象限5个细胞，总战20个细胞，5×104个），没有竭安排小烧杯中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下瞅察细胞数目切合央供.7、与1个96孔板，用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周，孔板盖正在酒粗灯上烤一下.8、用微量枪从小烧杯中与出细胞悬液（约100μl），依次滴进96孔板中（枪头至孔下1/3处），共时用移液枪吸与真足培植液（约100μl）动做对付照或者调整，边沿孔用无菌PBS弥补.9、滴完后，仍用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周.10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培植箱中举止培植.五 MTT真验1、交种细胞：用含10％胎牛血浑的培植液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞交种到96孔板，每孔体积100μl.2、称与3mg MTT粉终，加6ml真足培植液，配造成浓度5%的MTT溶液，的微孔滤膜除菌.3、培植细胞：共普遍培植条件，培植3－5天（可根据考查脚段战央供决断培植时间）.4、培植3－5天后，与出96孔板，用酒粗棉绕96孔板边沿处揩拭一周，孔板盖正在酒粗灯上烤一下.5、用（120μl）移液枪留神吸弃孔内培植上浑液（包罗调整孔内的培植上浑液），弃去枪头.再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包罗调整孔，但是边沿孔除中（枪头正在孔上1/3处）.6、呈色：继承孵育4小时，终止培植，留神吸弃孔内培植上浑液，对付于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培植上浑液.每孔加150μl DMSO，置摇床上振荡10分钟，使结晶物充分融解.7、比色：采用490nm波少，正在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸支值，记录截止，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标画造细胞死少直线.六复苏1、准备处事：开开恒温火浴锅，将温度安排正在37℃，与一离心管，加进5ml细胞培植基.2、与出冻存管，坐时搁进火浴锅中赶快摇摆，让冻存液赶快融化.3、用酒粗棉球揩洗冻存管中部以落矮传染机会.4、挨开冻存管，将冻存液留神变化到预先加进有培植基的离心管中，800rpm离心5分钟.5、留神弃掉上浑，加进约5ml培植基沉悬细胞.6、将所得细胞悬液变化进培植瓶中，盖上瓶塞，置培植箱培植.换液，传代真验用材：牛奶瓶2个---PBS缓冲液，DMEM培植基血浑瓶1个---胰蛋黑酶换液：移液管2个传代：培植瓶1个，移液管3个，离心管1个MTT真验用材：试剂：MTT粉，PBS缓冲液，真足培植液，两甲亚砜（DMSO）器材：96孔板，移液管，移液枪，烧杯，青霉素瓶若搞，小滤器，微孔滤膜除菌，酶联免疫检测仪.浑单：牛奶瓶1个，血浑瓶2个，培植瓶3个，移液管5个，离心管2-3个.。

细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。

2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。

3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。

可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。

4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。

5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。

6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。

首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。

7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。

细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。

细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。

而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。

细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。

2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。

3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。

一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。

4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。

然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。

最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。

细胞传代冻存复苏步骤细胞的传代冻存技术是生物医学研究中的一个重要方式。

该技术可以将细胞批量保存并长期维持其活性，以便进行进一步的研究。

细胞传代冻存的过程可以简单地概括为以下几个步骤：从培养皿中收集细胞，处理和停滞细胞增殖，添加冻存保护剂，将细胞悬液冷冻存储，最后进行复苏。

下面我们就详细描述一下这个具体步骤：1. 收集细胞收集细胞需要注意细胞的龄期，通常在细胞的对数生长期收集更好。

另外要注意细胞的数量不能过少或过多。

2. 停滞细胞增殖为了将细胞传代，减少增值周期并停滞细胞增殖是必要的。

对于一些高度增殖性的细胞，可以通过干预细胞内基因表达、添加生长因子等方式来实现。

一般可以使用过量的培养基，并将细胞保存在低吸附的容器中来停滞细胞增殖。

这样可以防止细胞形成多层，而保证单层生长。

3. 添加冻存保护剂添加冻存保护剂是细胞传代冻存的关键步骤之一。

冻存保护剂可以有效地保护细胞免受冻结脱水、冰晶形成和低温应力等因素的损害。

最常用的冻存保护剂是一些有机溶剂，例如DMSO（二甲基亚砜）、甘油等。

这些保护剂可以在细胞冷冻存储的过程中降低溶液的结冰点，防止冰晶的形成。

4. 冷冻存储在添加了冻存保护剂后，可以将细胞悬液装入冷冻管中，使用缓慢冷冻和液氮快速冷冻两种方法将细胞冷冻存储；液氮快速冷冻的方式冷冻效率高，但是会对细胞产生更大的应激，可能会降低细胞的复苏率。

缓慢冷冻是比较安全的方式，可以使用-80度的冰箱进行冷冻，时间从数小时到数日不等。

5. 复苏细胞冻存后，想要复苏它们，需要将细胞迅速退回到正常培养条件下。

此时需要谨慎地处理，以免破坏细胞结构和细胞膜等。

复苏的过程需要按照以下步骤：- 缓慢加热：将冻存细胞悬液从液氮中取出，快速将冻存管放入37度的水浴中，缓慢加热，让细胞悬浮在解冻液中的DMSO等有机溶剂逐渐被稀释。

- 洗涤：用无血清的培养基或PBS等洗涤一遍细胞，约10分钟，以去除有机溶剂。

- 均匀吸附：将无血清培养基或PBS加入细胞悬液中，让细胞吸附于培养皿上，约30分钟。

步骤不能再精细！细胞复苏、传代及冻存细胞复苏、传代及冻存实验步骤:一复苏传代（ 1）准备无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO2培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔（2）步骤1穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。

2 解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

3 开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。

4 加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。

5平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。

6培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。

7有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。

一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。

8细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。

9加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。

10加入4ml完全培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。

11转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加完全培养基至4ml。

12小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%CO2培养箱培养。

细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。

具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。

2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。

消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。

3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。

根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。

离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。

4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。

放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。

注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。

-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。

-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。

冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。

具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。

对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。

2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。

将冻存液预暖。

3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。

用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。

4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。

等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。

注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。

-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。

-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。

复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。

具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。