细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)

细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。

在显微镜下不同的细胞有不同的形态。

利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。

培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。

生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。

不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。

完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。

由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。

②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。

血清的分类最常用的是胎牛血清。

胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。

③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。

细胞培养基本步骤细胞培养是一项重要的生物技术，涉及到多个步骤。

以下是细胞培养的基本步骤：1. 准备细胞培养环境：细胞培养需要在无菌的环境中进行，因此需要准备无菌操作台、培养箱、显微镜、细胞计数器等设备，确保培养环境符合要求。

2. 细胞复苏：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速转移到37℃水浴中解冻。

然后将细胞移至培养瓶中，加入适量培养基，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布。

3. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可以进行传代。

将原培养瓶中的培养基吸出，加入适量胰蛋白酶，轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶与细胞接触。

等待几分钟，待细胞变圆并从瓶底脱落，将胰蛋白酶吸出。

然后加入新配置的培养基，用吸管吹打细胞团块，使其分散成单个细胞。

最后将细胞悬液移至新的培养瓶中，放在培养箱中继续培养。

4. 细胞冻存：当需要进行长期保存时，可以将细胞冻存。

将细胞从培养箱中取出，离心收集，用适量细胞冻存液重悬细胞。

然后将细胞悬液分装到冻存管中，放入-80℃冰箱或液氮中保存。

5. 细胞观察：在细胞培养过程中，需要定期观察细胞的生长情况。

通过显微镜观察细胞的形态、密度等指标，判断细胞的生长状态和是否发生异常。

如发现异常情况，应及时采取措施处理。

6. 细胞计数和活力检测：采用细胞计数器或血球计数板进行细胞计数，同时检测细胞的活力。

一般采用台盼蓝染色法或荧光染色法进行检测。

7. 细胞换液和传代：根据需要，定期更换新鲜的培养基，以保证细胞的营养需求。

同时，在传代过程中要注意细胞的消化程度和生长情况，避免过度生长或未充分消化导致细胞状态不佳。

总之，细胞培养是一项技术性很强的工作，需要严格的操作规程和细致的观察。

通过不断实践和总结经验，可以提高细胞培养的成功率和稳定性。

细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37℃水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.min-1离心5 min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。

2、换液（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。

3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入2 mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。

4、冻存（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100 uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80℃冻存。

1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷；2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS 冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。

4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。

5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。

细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。

一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。

（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。

（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。

2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。

生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。

吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。

反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。

进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。

（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。

细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。

注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。

降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。

三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。

（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

细胞实验乳腺组织块贴壁迁出细胞后胰酶消化：先把培养液、pbs、胰酶消化液放37℃水浴锅，倒掉培养液，加入0.25%（0.125%也可以）胰酶3 min，镜下观察细胞消化情况。

若消化不完全则继续消化，消化完全则加入等量培养液终止消化，反复吹打，将液体加入1.5 ml离心管。

对于一次难以消化下来的组织块，可以多加几次胰酶，每次消化后都要加入pbs洗一洗，然后再加入胰酶继续消化。

将离心管1000 rpm离心5分钟，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。

细胞换液：将pbs、培养液放37度水浴锅预热。

取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液，用pbs洗一遍（杂质较多时可洗两遍），从壁上加入培养液。

细胞传代：先把培养液、pbs、胰酶消化液放于37℃水浴锅，取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液。

加入0.25%胰酶，消化3 min，镜下观察消化情况。

消化完全则加入等量培养液终止消化，加入离心管内，1000 rpm离心5 min，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。

标记传了第几代。

注意：（1）293T细胞只需用胰酶消化大概1 min，不用放入培养箱；（2）293T 细胞不需要用PBS重悬，直接加培养液重悬。

对于加入裂解液或者原代培养的细胞需要PBS重悬来洗杂质；（3）加入6孔板时，用1 ml培养液重悬后，每孔加入100 μl。

可根据细胞数量调整加入的量。

细胞复苏：1.调节水温至37℃，取出细胞（4#5号第四格），放入手套中再浸入水中解冻；2.1000 rpm离心5 min，弃上清，用PBS清洗1遍（做磁珠的话用Buffer洗），加入培养液培养。

细胞冻存：需冻存的细胞先用PBS洗一遍，再加入胰酶消化3 min，1050 rpm离心5 min。

沉淀用细胞冻存液重悬，加入冻存管，-80℃保存过夜，第二天转移到液氮罐（4#5号第四格）。

注意：1.配置10% DMSO细胞冻存液：900 μl过滤的血清+100 μl DMSO。

细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。

本文将对这些问题进行讲解。

一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。

由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。

复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。

2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。

3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。

换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。

2、向细胞培养管中加入新的培养液。

3、培养之前搅拌均匀。

4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。

三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。

传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。

每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。

2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。

3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。

4、传代时需要更换新的培养基。

四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。

冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。

2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。

3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。

总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。

只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。

THP-1培养1、细胞复苏：从液氮罐中快速取出细胞，然后在37度水浴中快速摇动约1-2min，水面要在冻存管盖以下，防止水进入冻存管。

2、转入平板：在超净台中，取一平板，先加入12ml 1640培养液，铺满板底，然后把冻存管中的细胞全部吸到平板中，8字摇匀，显微观察状况，然后37度培养；3、细胞换液：复苏过夜后，观察培养液有变黄(2-3天)，此时换液，先把细胞液全部吸入15ml离心管中，900-1000r/min离心5min，（转速不能大于1000），吸掉上层培养液，加入新的1640，吹匀，全部吸到培养板中，37度培养。

4、传代：悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）悬浮细胞传代，如果需要做实验大量扩增细胞的话，可以传代前先将培养瓶直立静置，待大部分细胞都沉降的细胞瓶底，勿晃动，轻轻吸出培养基，再加入新鲜培养基即可。

这样细胞数目不会损失多少，而且上层吸去的也是死细胞。

但建议加入新鲜培养基后分瓶扩增，毕竟一个较小的空间和有限的培养基环境下细胞扩增有限。

如果暂时不要做实验，只是维持传代的话，只要将大部分培养基吸去，留一点儿在瓶底，再加入新鲜培养基即可。

至于悬浮细胞何时传代合适，个人经验（我只养过THP-1和U937两种悬浮细胞）是待培养基变黄有些过，这时显示培养基已明显偏酸，对细胞并不适宜。

一般待培养基开始变黄，这时将细胞瓶放平，细胞能密密麻麻铺满整个瓶底就要传代了，这表明细胞的生长空间要不够了，就需传代分瓶扩增。

5、冻存液：20% 1640+70%胎牛血清+10%DMSO （ATCC里边有说明）；(7:2:1)梯度降温冻存，4度，30min；-20度，1h；-80度，过夜；然后转入液氮。

细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。

具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。

2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。

消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。

3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。

根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。

离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。

4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。

放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。

注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。

-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。

-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。

冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。

具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。

对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。

2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。

将冻存液预暖。

3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。

用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。

4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。

等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。

注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。

-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。

-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。

复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。

具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。

细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。

②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。

二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。

其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。

细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

（二）细胞传代培养具体操作1、细胞：贴壁细胞株2、操作步骤1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。

随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml 培养液终止消化。

观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。

一般室温消化时间约为1-3分钟。

4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。

第二天观察贴壁生长情况。

细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。

3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。

吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。

4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。

5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。

-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。

细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸，C、塑料器皿1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，5. 50ml离心管，6. 胶塞，D、其他物品1. 微量加样枪，2. 红血球计数板，F、试剂1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA7. 二甲基亚砜（DMSO），8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。

一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1.贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2遍，5分钟/次。

取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。

待24小时候补液。

或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

细胞培养相关实验1、复苏细胞步骤：从-80℃冰箱或者-196℃液氮罐中取出细胞（握手心），快速放在37℃水浴箱（提前预热至37℃）轻轻摇晃至变成溶液。

吸取细胞溶液至培养瓶，加入4ml 含10%胎牛血清（FBS）的培养液（DMEM/1640），放37℃、5%CO2敷箱中孵育。

快溶的理由：复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。

一般细胞复苏第二天给细胞换液。

2、细胞换液的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）从孵育箱取出培养瓶，直接倒去细胞培养液；2）用枪从离心管中吸取4ml 含10%FBS的DMEM/RPMI 1640，加入培养瓶中；3）酒精喷洒消毒后放入37℃敷箱孵育。

一般2天左右更换细胞培养液，刚复苏的细胞第二天更换培养液。

3、细胞传代的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、FBS，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）直接倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml清洗培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，后倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞；8）细胞分装传代100～500ul/瓶培养，可按1:（2～4）传代，后加入4～5ml含10%FBS培养液，放入37℃5%CO2敷箱中孵育。

4、细胞冻存的步骤：1）离心后的细胞加入冻存液（DMSO：FBS：DMEM=1:3:6）吹打成单细胞悬液，加入冻存管1ml/管，A、放4℃30分钟，-20℃30分钟，-80℃过夜或者-196℃液氮罐永久保存；或者B、放装有异丙醇的冻存盒直接放-80℃冰箱冻存。

简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷
冻的操作方法
动物细胞培养过程中的细胞复苏、传代和冷冻是常见的操作步骤。

具体方法如下：
1. 细胞复苏：
a. 将冷冻保存的细胞样品快速解冻，可以将冰冻管置于37°C的水浴中缓慢解冻。

b. 解冻后，将细胞迅速转移到含有预暖的培养基的离心管中。

c. 用培养基轻轻洗涤细胞，并将其移至培养皿中，使细胞附着于培养器皿表面。

d. 增加足够的预热培养基，将细胞放回合适的培养条件中进行复苏。

2. 细胞传代：
a. 当细胞达到适当的密度或已达到培养器皿的最大生长容量时，需要进行细胞传代。

b. 首先，先用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。

c. 使用无菌酶消化液（如胰蛋白酶）轻轻润湿细胞，然后加入等量的无菌培养基来停止消化。

d. 耐心地将细胞悬浮液吸取并转移到新的培养皿中，保持适当的稀释比例，并加入新的预热培养基。

e. 将新的培养皿放入培养箱中，提供适当的温度、湿度和氧气供应。

3. 细胞冷冻：
a. 将细胞按照细胞传代的方法进行收获和洗涤。

b. 用细胞冻存试剂（如DMSO）缓慢添加到细胞悬浮液中，最终细胞密度通常为1-2×10^6个细胞/mL。

c. 将细胞悬浮液转移至预冷的冻存管中。

d. 快速将冷冻管放入冷冻等温器中，以确保细胞迅速冷冻。

e. 细胞冷冻后，将冷冻管转移到液氮罐中进行长期储存。

请注意，动物细胞培养的具体操作方法可能因细胞类型和研究需要而有所不同。

在进行这些操作之前，应仔细阅读并遵守相应的实验室指南和安全操作规程。

细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。

细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。

下面将详细讨论这些过程。

细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。

2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。

3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。

4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。

5.定期观察细胞的生长情况。

细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。

3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。

4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。

5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。

冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。

2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。

3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。

4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。

5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。

6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。

7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。

显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。

超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。

带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。

基培需写上开启时间。

细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。

所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。

步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。

弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。

消化：加入1ml 0。

25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。

5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。

6。

吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。

（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。

培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。

转染时细胞密度需达到70-90%。

以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。

取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。

3T3-L1细胞培养一、复苏冻存的3T3-L1细胞1 从液氮罐中用镊子拿出冻存的细胞，迅速放入37 ℃浴中，溶解约1min 取出（要留小部分冰不融化）。

2 打开前用75%的酒精清洗冻存管外壁，打开后，移入小号培养瓶，立即加入4~5mL培养基，稀释DMSO，然后放入培养箱。

二、冻存的3T3-L1细胞1 当细胞长到70~80%时，消化细胞。

去除培养基，用5mL 1*PBS 洗去残留培养基，加入1mL 胰酶，轻晃培养瓶，使胰酶覆盖整个培养瓶底部，放入培养箱消化2~3min。

2 加入3~4mL DMEM(10%NBS) 终止消化，轻轻吹打使细胞均匀。

3 取1/5的量移入大培养瓶继续培养。

4取700uL加入冻存管中，，向冻存管中加入100uL DMSO，200uL FBS。

放入程序降温盒，再放入-80度冰箱过夜，第二天拿出放入液氮罐，记录存放位置。

5 每消化一次，细胞代数增加一次，要记录清楚。

三、3T3-L1细胞换液1 新复苏或消化的细胞，在种入新培养瓶5~6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。

2 每两天换一次液；待细胞长到70~80%时，进行消化，消化步骤如上所述。

四、种入24孔板1 种入24孔板前，细胞要进行消化，步骤如上所述。

2 计算好传代和种入板中的量。

如：大号培养瓶中细胞长到70~80%进行消化，加入1.5mL胰酶消化，加入4mL 培养基终止消化。

其中0.5mL用于继续培养，剩余5mL, 每一24孔板需要1/5的量。

3 24孔板事先铺0.5%的明胶。

注意事项：1 从液氮中拿出冻存管时尽量不要用手碰，以免冻伤。

2 冻存管取出后迅速放入水浴中，培养基使用前可以先用37度预热。

3 冻存管打开前要用酒精消毒，防止污染。

4 尽快加入培养基稀释DMSO，防止DMSO对细胞毒性作用。

5 冻存复苏细胞遵循“慢冻快融”原则。

6 程序降温盒内是异丙醇，用5次更换一次异丙醇。

7 若没有程序降温盒，可将细胞放入4度冰箱1h，-20度冰箱1h，再放入-80度过夜。