细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)

细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。

在显微镜下不同的细胞有不同的形态。

利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。

培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。

生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。

不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。

完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。

由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。

②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。

血清的分类最常用的是胎牛血清。

胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。

③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。

打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。

紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。

1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。

将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。

然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。

在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。

1000rpm, 离心3分钟。

弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。

此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。

贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。

细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37℃水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.min-1离心5 min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。

2、换液（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。

3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入2 mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。

4、冻存（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100 uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80℃冻存。

1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷；2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS 冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。

4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。

5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。

细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。

一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。

（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。

（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。

2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。

生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。

吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。

反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。

进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。

（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。

细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。

注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。

降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。

三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。

当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。

（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。

加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。

细胞实验乳腺组织块贴壁迁出细胞后胰酶消化：先把培养液、pbs、胰酶消化液放37℃水浴锅，倒掉培养液，加入0.25%（0.125%也可以）胰酶3 min，镜下观察细胞消化情况。

若消化不完全则继续消化，消化完全则加入等量培养液终止消化，反复吹打，将液体加入1.5 ml离心管。

对于一次难以消化下来的组织块，可以多加几次胰酶，每次消化后都要加入pbs洗一洗，然后再加入胰酶继续消化。

将离心管1000 rpm离心5分钟，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。

细胞换液：将pbs、培养液放37度水浴锅预热。

取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液，用pbs洗一遍（杂质较多时可洗两遍），从壁上加入培养液。

细胞传代：先把培养液、pbs、胰酶消化液放于37℃水浴锅，取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液。

加入0.25%胰酶，消化3 min，镜下观察消化情况。

消化完全则加入等量培养液终止消化，加入离心管内，1000 rpm离心5 min，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。

标记传了第几代。

注意：（1）293T细胞只需用胰酶消化大概1 min，不用放入培养箱；（2）293T 细胞不需要用PBS重悬，直接加培养液重悬。

对于加入裂解液或者原代培养的细胞需要PBS重悬来洗杂质；（3）加入6孔板时，用1 ml培养液重悬后，每孔加入100 μl。

可根据细胞数量调整加入的量。

细胞复苏：1.调节水温至37℃，取出细胞（4#5号第四格），放入手套中再浸入水中解冻；2.1000 rpm离心5 min，弃上清，用PBS清洗1遍（做磁珠的话用Buffer洗），加入培养液培养。

细胞冻存：需冻存的细胞先用PBS洗一遍，再加入胰酶消化3 min，1050 rpm离心5 min。

沉淀用细胞冻存液重悬，加入冻存管，-80℃保存过夜，第二天转移到液氮罐（4#5号第四格）。

注意：1.配置10% DMSO细胞冻存液：900 μl过滤的血清+100 μl DMSO。

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至38℃。

打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1500r/min离心4min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。

细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。

2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。

②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。

二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。

添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。

2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。

其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。

细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸，C、塑料器皿1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，5. 50ml离心管，6. 胶塞，D、其他物品1. 微量加样枪，2. 红血球计数板，F、试剂1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDTA7. 二甲基亚砜（DMSO），8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。

一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1.贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2遍，5分钟/次。

取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。

待24小时候补液。

或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

细胞培养相关实验1、复苏细胞步骤：从-80℃冰箱或者-196℃液氮罐中取出细胞（握手心），快速放在37℃水浴箱（提前预热至37℃）轻轻摇晃至变成溶液。

吸取细胞溶液至培养瓶，加入4ml 含10%胎牛血清（FBS）的培养液（DMEM/1640），放37℃、5%CO2敷箱中孵育。

快溶的理由：复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。

一般细胞复苏第二天给细胞换液。

2、细胞换液的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）从孵育箱取出培养瓶，直接倒去细胞培养液；2）用枪从离心管中吸取4ml 含10%FBS的DMEM/RPMI 1640，加入培养瓶中；3）酒精喷洒消毒后放入37℃敷箱孵育。

一般2天左右更换细胞培养液，刚复苏的细胞第二天更换培养液。

3、细胞传代的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、FBS，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）直接倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml清洗培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，后倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞；8）细胞分装传代100～500ul/瓶培养，可按1:（2～4）传代，后加入4～5ml含10%FBS培养液，放入37℃5%CO2敷箱中孵育。

4、细胞冻存的步骤：1）离心后的细胞加入冻存液（DMSO：FBS：DMEM=1:3:6）吹打成单细胞悬液，加入冻存管1ml/管，A、放4℃30分钟，-20℃30分钟，-80℃过夜或者-196℃液氮罐永久保存；或者B、放装有异丙醇的冻存盒直接放-80℃冰箱冻存。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。

3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。

4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。

5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。

7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。

面做好标志，注明细胞、组别及日期。

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。

显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。

超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。

带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。

基培需写上开启时间。

细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。

所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。

步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。

弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。

消化：加入1ml 0。

25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。

5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。

6。

吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。

（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。

培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。

转染时细胞密度需达到70-90%。

以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。

取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。

3T3-L1细胞培养一、复苏冻存的3T3-L1细胞1 从液氮罐中用镊子拿出冻存的细胞，迅速放入37 ℃浴中，溶解约1min 取出（要留小部分冰不融化）。

2 打开前用75%的酒精清洗冻存管外壁，打开后，移入小号培养瓶，立即加入4~5mL培养基，稀释DMSO，然后放入培养箱。

二、冻存的3T3-L1细胞1 当细胞长到70~80%时，消化细胞。

去除培养基，用5mL 1*PBS 洗去残留培养基，加入1mL 胰酶，轻晃培养瓶，使胰酶覆盖整个培养瓶底部，放入培养箱消化2~3min。

2 加入3~4mL DMEM(10%NBS) 终止消化，轻轻吹打使细胞均匀。

3 取1/5的量移入大培养瓶继续培养。

4取700uL加入冻存管中，，向冻存管中加入100uL DMSO，200uL FBS。

放入程序降温盒，再放入-80度冰箱过夜，第二天拿出放入液氮罐，记录存放位置。

5 每消化一次，细胞代数增加一次，要记录清楚。

三、3T3-L1细胞换液1 新复苏或消化的细胞，在种入新培养瓶5~6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。

2 每两天换一次液；待细胞长到70~80%时，进行消化，消化步骤如上所述。

四、种入24孔板1 种入24孔板前，细胞要进行消化，步骤如上所述。

2 计算好传代和种入板中的量。

如：大号培养瓶中细胞长到70~80%进行消化，加入1.5mL胰酶消化，加入4mL 培养基终止消化。

其中0.5mL用于继续培养，剩余5mL, 每一24孔板需要1/5的量。

3 24孔板事先铺0.5%的明胶。

注意事项：1 从液氮中拿出冻存管时尽量不要用手碰，以免冻伤。

2 冻存管取出后迅速放入水浴中，培养基使用前可以先用37度预热。

3 冻存管打开前要用酒精消毒，防止污染。

4 尽快加入培养基稀释DMSO，防止DMSO对细胞毒性作用。

5 冻存复苏细胞遵循“慢冻快融”原则。

6 程序降温盒内是异丙醇，用5次更换一次异丙醇。

7 若没有程序降温盒，可将细胞放入4度冰箱1h，-20度冰箱1h，再放入-80度过夜。