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细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。
2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。
吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。
反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。
进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。
（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。
细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。
注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。
降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
293T细胞培养准则操作规程
百利药业⽣物药研发部
标准操作规程
题⽬：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）⽇期：年⽉⽇
批准者：（签名）⽇期：年⽉⽇
按照⽣物安全柜的标准操作规程，将⽣物安全柜的紫外开启半⼩时。
3.2将含10%胎⽜⾎清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃⽔浴锅中预热。
3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO
培养箱中取出，先⽤75%的酒
2
精喷洒于瓶表⾯，将细胞培养瓶旋转放于⽣物安全柜中，⽤⽆菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤⼀次，吸净PBS。
3.2.2将含EDTA-0.25%tyption⽤PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加⼊3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表⾯。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎⽜⾎清的DMEM终⽌反应，⽤移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，
将细胞液移到15ml⽆菌的离⼼管中，1000rpm离⼼3分钟。
3.2.3将离⼼上清吸弃掉，⽤⼿指轻轻拍打离⼼管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取⼀定量的细胞液进⾏n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进⾏。
3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进⾏传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO
培养箱中培养。
2
3.2.5 24⼩时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进⾏下⼀次传代培养。
293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
一、293T细胞的冻存1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2.在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6.细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS+ 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9.分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11.复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
二.293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2.消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
三. 293T细胞的复苏1.当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6.第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
用于包装的293T细胞(ATCC No.CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
Tips：HEK293细胞培养⼩技巧把握关键提升细胞成活率很多⼈对细胞培养都是⼜爱⼜恨“情不知所起，⼀往情深” 初⼊细胞培养的⼤坑总要摸索⼀番，才能领悟其精髓⽽前辈经验更是如同指路明灯让⼈瞬间醍醐灌顶，豁然开朗。
293细胞明显适应酸性环境，pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁⽣长,，换液时动作要轻。
⼀般⽤⾼糖的DMEM培养基。
传代：倒去废液，PBS洗⼀次（轻），⽤0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，⽣长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表⾯,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作⽤30s，镜下观察细胞变圆,就可添加培养基（DMEM，10%FBS)终⽌消化，反复吹打⾄细胞全成单个悬浮细胞即可。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，建议传代⽐例为1：3~1：6。
293细胞在低代时容易贴壁，⽣长良好，在传到⼏⼗代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，⽤PBS 冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购⼊时先⼤量冻存。
复苏293细胞的另⼀⽣长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。
细胞复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种⾄2个50ml瓶中时较为合适。
刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24⼩时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动⽽影响细胞贴壁。
复苏后48⼩时左右观察贴壁情况并进⾏⾸次更换培养基⽐较合适，另外需要注意的是在细胞传代或换液步骤前，需要将培养基提前预热。
转染：293细胞进⾏细胞转染时，如果是采⽤磷酸钙转染，⼀定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加⼊磷酸钙就会使293细胞⼤⽚的脱落，最好是当293⽣长到1/2或2/3时进⾏磷酸钙转染，可以避免细胞的⼤量脱落。
—END—。
