应用噬菌体抗体库技术制备抗体

2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。

与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。

其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。

3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。

经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。

3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。

利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。

3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。

通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。

针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。

第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。

细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。

这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。

人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。

其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。

抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。

本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。

关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。

单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。

然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。

因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。

随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。

１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。

至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。

人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。

人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。

人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。

噬菌体抗体是指能够特异性识别和结合噬菌体的抗体。

噬菌体是一类可以感染细菌和病毒的微生物，它们通常具有一个由蛋白质外壳和内部基因组组成的结构。

噬菌体抗体的产生通常是由于人体免疫系统识别噬菌体表面的
抗原表位而引发的。

这些抗原表位可以是蛋白质、糖类或者其他化学物质，它们能够刺激免疫系统产生相应的抗体。

这些抗体可以与噬菌体表面的抗原表位结合，从而阻止噬菌体对细胞的感染。

噬菌体抗体在医学和生物学领域具有广泛的应用价值。

例如，可以利用噬菌体抗体来研究病毒的感染机制和病毒与宿主细胞之间的
相互作用。

此外，噬菌体抗体也可以用于治疗病毒感染和抗生素耐药感染。

在实践中，噬菌体抗体的制备通常需要使用动物模型或者体外实验方法。

例如，可以使用病毒蛋白或者噬菌体表面蛋白来免疫动物，以刺激动物产生相应的抗体。

然后，可以从动物的血清中提取出抗体，用于进一步的研究或治疗。

总之，噬菌体抗体是一种具有重要应用价值的抗体，它可以帮助我们更好地理解病毒的感染机制和病毒与宿主细胞之间的相互作用，同时也为治疗病毒感染和抗生素耐药感染提供了新的思路和方法。

纳米抗体筛选一、纳米抗体简介1.纳米抗体发现及结构1993年，Hamers-Casterman教授以及他的同事们在骆驼的血清中发现了一种与传统抗体结构不同的新型抗体，这种抗体仅仅由两条重链构成，被称为重链抗体(heavy-chain antibody, HCAb)。

重链抗体的重链的可变区称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，通过体外重组表达制备的VHH 分子质量仅仅为15kDa，是传统抗体的十分之一左右，是抗原结合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被称为纳米抗体(nanobody, Nb)。

传统抗体（左）、重链抗体（中）和纳米抗体（右）的结构由于没有轻链，纳米抗体仅有3个属于重链的抗原识别区域（CDRs 区）。

为了弥补缺少的轻链CDRs的生物学活性，纳米抗体在CDR3部分增加了氨基酸长度（16~18个氨基酸残基，对应的传统抗体的CDR3有8-15个氨基酸），以增加CDR的多样性和特异性。

另外，纳米抗体的CDR3 区域可形成一个大的暴露的凸环，像“手指”一样延伸到抗原的缝隙或者裂口中，可以接触到传统抗体不能接触的抗原表位。

CDR3凸环中的一个半胱氨酸还可以与CDR1 或FR2 的45 位点的半胱氨酸形成二硫键，可使纳米抗体的生物结构相对稳定，大大降低纳米抗体与抗原结合所需能量，使得高亲和力的纳米抗体的获得较容易。

纳米抗体和VH结构示意图2.纳米抗体优势（1）纳米抗体理化特性较稳定（2）纳米抗体的大规模生产较容易实现（3）纳米抗体免疫原性低（4）纳米抗体分子量小，组织渗透能力强，血液清除较快（5）纳米抗体可以识别传统抗体不能识别的位点（6）纳米抗体具备形成多聚体的能力3.纳米抗体筛选纳米抗体筛选和制备纳米抗体的获得现在普遍通过免疫羊驼，从羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到高亲和力的抗体序列。

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定罗弋;庞华;李淑杰;曹辉;李少林;樊春波;王洁【摘要】目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)肺腺癌人源单链抗体.方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PeR)将V_H和V_L连接得剑单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiⅠ和NotⅠ双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxⅠ为靶抗原对抗体库进行筛选富集.将阳性克隆用IPTG诱导表达.用SDS-PAGE及Western blotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性.结果成功构建噬菌体单链抗体库.ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带.在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集.收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测剑其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%.SDS-PAGE及Western blotting证实抗体得到可溶表达.ELISA及免疫细胞化学检测表明抗体能相对特异地与肺腺癌细胞结合.结论成功构建肺腺癌人源噬菌体抗体库,并从中筛选得到能相对特异地与高表达Prx Ⅰ的肺腺癌细胞D549结合的单链抗体.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2010(030)001【总页数】5页(P30-34)【关键词】噬菌体抗体库;单链抗体;Peroxiredoxin Ⅰ;肺腺癌【作者】罗弋;庞华;李淑杰;曹辉;李少林;樊春波;王洁【作者单位】重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,附属第一医院核医学科,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,附属第一医院核医学科,重庆400016【正文语种】中文【中图分类】Q78肺癌是严重威胁人类健康的疾病。

噬菌体的应用和原理引言噬菌体是一种寄生于细菌体内并以细菌为宿主的病毒，这种病毒能够感染特定类型的细菌并利用其细胞机制进行繁殖。

噬菌体不仅对细菌的研究有重要意义，而且在基因工程、抗菌治疗等领域具有潜在的应用前景。

本文将介绍噬菌体的应用和原理。

噬菌体的特点•结构简单：噬菌体由蛋白质壳和DNA/RNA组成，通常呈现棒状或类似陀螺的形状。

噬菌体的大小和形状因种类而异。

•寄生性：噬菌体不能自主繁殖，需要依靠细菌的细胞机制进行复制。

•高度专一性：不同种类的噬菌体对不同种类的细菌具有高度专一性，只能感染特定的细菌种类。

噬菌体的应用基因工程研究噬菌体在基因工程研究中发挥重要作用，尤其是噬菌体生物展示系统。

这种系统通过将目标蛋白质基因插入噬菌体基因组中，使得噬菌体在感染细菌时能够在细菌表面展示目标蛋白质。

这一系统可以用于研究蛋白质结构、功能、相互作用等。

此外，噬菌体展示系统还可以用于制备重组蛋白质，例如制备抗体和蛋白质药物。

抗菌治疗噬菌体在抗菌治疗方面具有潜在的应用前景。

由于噬菌体对细菌具有高度专一性，能够选择性地感染并杀死目标细菌，因此被认为是一种潜在的替代抗生素的疗法。

噬菌体治疗对于多药耐药菌的治疗尤为重要，因为噬菌体可以通过感染和杀死这些耐药菌来解决抗生素耐药问题。

食品安全噬菌体还可以应用于食品安全领域。

食品中可能存在细菌污染，这些细菌有时会引发食品中毒事件。

通过使用噬菌体，在食品生产过程中可以对细菌进行灭菌，从而提高食品的安全性。

噬菌体的高度专一性保证了不会对其他有益菌种造成伤害，从而在不影响食品质量的情况下确保了食品安全。

噬菌体的原理吸附与侵染噬菌体通过尾纤毛等结构物与细菌表面的受体结合，从而实现对细菌的吸附。

随后，噬菌体释放其基因组，使其进入细菌细胞内。

噬菌体的基因组会利用宿主细菌的细胞机制进行复制，最终导致细菌的溶解和噬菌体的释放。

寄生与复制噬菌体寄生细菌是通过利用细菌的细胞机制进行复制的。

噬菌体基因组会利用细菌的酶和蛋白质合成机制，合成新的噬菌体DNA和蛋白质。