最新噬菌体抗体库技术

全面解读诺贝尔化学奖之噬菌体展示技术当2018年诺贝尔化学奖颁布的那一刻，我禁不住高呼一声：今年的三大自然科学奖项都被生物学给“收入囊中”了。

别的不说，就说噬菌体展示技术，经过义翘神州十多年的应用改善，已经成为公司抗体制备技术的主要手段，制备开发的抗体近万种，还有几种抗体药物也在临床试验阶段。

为了让大家对噬菌体展示技术有更加清晰的了解，我结合公司十多年的抗体研发生产经验写了本文，希望给大家带来帮助。

1.噬菌体展示技术的发展进化之路1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。

1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为106的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。

而Sir Gregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。

噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。

随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。

然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。

再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

题目：噬菌体文库系列——抗体亲和力成熟摘要：多策略组合应用，搭配噬菌体展示技术，效果棒棒哒近年来，随着抗体药物的广泛上市，抗体已经取代基因治疗成为生物制药领域的主要生力军。

而抗体在疾病诊断、治疗和预防方面的作用很大程度上取决于其亲和力的高低，随着抗体工程技术的不断发展，如何提高抗体亲和力已成为抗体工程的难题之一。

围绕这一问题人们已经从不同的角度展开了研究，例如，提高抗体库的质量、增加抗体库的多样性、进行抗体重链或轻链的替换以及点突变有目的进行氨基酸替换等都能不同程度地提高抗体亲和力。

抗体亲和力表示抗体与抗原结合能力的大小。

抗体亲和力成熟是指机体正常存在的一种免疫功能状态。

在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答，这种现象称为抗体亲和力成熟。

噬菌体展示技术作为一种先进的抗体库构建技术能结合多种技术手段，于体外实现抗体的亲和成熟，并配合亲和筛选方法获得具有高亲和力的抗体。

在噬菌体抗体展示技术中，VH和VL基因的随机重组，在一定程度上模拟了体内抗体亲和力成熟的过程。

如果结合其它技术则可以使抗体的亲和力提高到一个更高的层次，下面介绍一些抗体亲和力成熟的方法。

体外抗体亲和力成熟的几种策略要想实现抗体的亲和力体外成熟，就必须充分地了解天然抗体的亲和力体内成熟原理，设计模拟体内可能出现和存在的变化，从而促进抗体的体外进化。

天然抗体的亲和力成熟可以分为体细胞高频突变和克隆选择两个过程。

在天然抗体亲和力成熟的过程中，抗原刺激下的体细胞高频突变有着举足轻重的作用，因此亲和力体外成熟的策略也多在抗体基因突变水平上，即采用各种突变方法来模拟体内的高频突变。

1.随机突变（1）错配PCR通过改变PCR反应条件，提高核酸错配率将随机突变引入基因序列。

该技术可以通过提高镁离子浓度、加入锰离子、失衡4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）浓度、使用低保真DNA 聚合酶等方法，来提高抗体基因的突变率。

除此之外，突变率的高低也可以采用改变模板DNA 的复制次数进行控制。

噬菌体展示总结技术各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术噬菌体展示技术关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。

到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。

本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。

关键词：噬菌体展示；组装；融和蛋白1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。

该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。

另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。

近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。

一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。

思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。

肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集[2]。

这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。

由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。

在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。

这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。

这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。

TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。

我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。

使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。

3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。

分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。

用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。

通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。

6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。

目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。

贮存于含50%甘油的TBS溶液中。

复杂度~2.7×109个转化子。

•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。

该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。

贮存于-70℃。

•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。

概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。

噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。

这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。

由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。

在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。

这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。

这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。

TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。

我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。

使用此文库之前请认真阅读以下材料确认收到以上材料2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。

3. 参照方案G制备KM134. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。

分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。

用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。

通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%）5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用聚丙烯管。

6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4）(1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃震荡过夜培养(2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在0.4。

噬菌体展示技术吴楚1,诸慧2　(1.温州大学生命与环境科学学院,浙江温州325027;2.温州科技职业学院,浙江温州325000)摘要　概述了噬菌体展示技术的基本原理,常用的噬菌体表面展示系统以及噬菌体展示技术的应用、展望等方面,并在抗原表位分析和疫苗的研制、人工抗体、多肽药物的开发等方面,进行了探讨。

关键词　噬菌体;展示技术;亲和富集法筛选中图分类号　S188 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)03-00990-03基金项目　温州大学科研项目(2003Y 31);温州市科技计划项目(G 20204084)。

作者简介　吴楚(1974-),男,浙江温州人,讲师,从事环境微生物学研究。

收稿日期　2008211206 噬菌体展示技术(Phage Display T echniques ,PDT )是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示在其表面,同时将遗传密码信息整合到噬菌体的基因组中的一种技术。

该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,即在噬菌体的表面展示特定蛋白质,而在噬菌体核心DNA 中则含有该蛋白的结构基因。

另外,这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来,可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。

随着肽展示库展示内容的多样化及展示库质量的提高,人们利用目标蛋白来筛选噬菌体展示库,能很容易获得相应的配体,通过分析所获肽段的序列及结构,就能准确地分析出蛋白分子间,如抗原抗体反应、受体与配体、酶与底物之间的相互作用机制及相应分子的特征。

因此,自1985年G eorge S m ith 首次将外源抗原决定簇与丝状噬菌体的次要外壳蛋白融合以来[1],噬菌体展示被用于免疫学、细胞生物学及药物开发等领域,成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术。

1　噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术是一种将基因表达产物和亲和筛选相结合的技术[2],它以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的基因,使其基因表达产物在噬菌体表面展示,进而通过亲和富集法筛选有特异肽或蛋白质的噬菌体。

・综述・ScFv 噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用侯俊然　何蔼　詹希美 摘要　随着蛋白组学时代的到来,对目的抗体的需求量的增加,噬菌体抗体库技术获得抗体的优越性得到充分发挥。

该文主要介绍噬菌体抗体库技术的重要一种ScFv (单链抗体)噬菌体抗体库技术。

从理想ScFv 噬菌体抗体库的构建、可溶性表达、液体和固体筛选的优缺点及其在寄生虫学的应用等几个方面对此技术的研究进展作一综述。

关键词　噬菌体抗体库;可溶性表达;筛选;ScFv作者单位:510080广州,中山大学基础医学院寄生虫学教研室E 2mail :houjunran2003@ 电话:020********* 单链抗体(single 2chain antibody fragment ,ScFv ),仅为完整抗体的六分之一,相对分子质量(Mr )约为27000,由轻链可变区(vl )和重链可变区(vh )之间通过14～15个氨基酸的弹性小肽连接形成,具有许多优点:体积小,免疫原性低,不易引起人体排斥反应;无Fc 段,不易与具有Fc 受体的非靶细胞结合,成像清晰;渗透性好,能有效穿透致密的组织屏障;易于基因操作和基因工程大量生产。

在诊断和治疗方面有广泛的应用前景,将成为基因工程抗体技术的重要方法之一。

1　ScFv 噬菌体抗体库的技术流程从有关的细胞(免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞等)克隆出抗体可变区Ig G ,设计引物,利用PCR 扩增出轻链可变区(vl )和重链可变区(vh ),用一段弹性连接肽将其连接,构成单链抗体ScFv 。

重组到噬菌体表达载体中,感染宿主菌,通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单链抗体ScFv 表达在噬菌体表面,利用特异性抗原进行筛选,并重复筛选过程,达到抗体的富集。

2　ScFv 噬菌体抗体库技术2.1　理想ScFv 噬菌体抗体库的构建Okamoto[1]认为理想ScFv 噬菌体抗体库是包含所有抗体可变区的功能位点,包含所有抗体组合形式,抗体多样性最大。