基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子-1单链抗体及其效价检测刘纯宝;宋夷龄;张永学【摘要】目的：从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子‐1（Vcam‐1）的单链抗体，纯化浓缩后进行亲和性鉴定，并与单克隆抗体效价进行比较。

方法扩增Vcam‐1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam‐1抗原蛋白，纯化后包被免疫管，通过4轮压力逐渐增大的“吸附‐洗脱‐扩增”过程筛选获得阳性克隆。

对阳性克隆进行ELISA检测，选取效价高的克隆送予测序并转入大肠埃希菌进行表达，认定高表达的样品为最终的阳性克隆。

将该阳性克隆转染入感受态细胞表达单链抗体，纯化后经ELISA检测并评价其抗原亲和性。

结果真核细胞表达的Vcam‐1抗原蛋白的分子量为85～90 kD。

以Vcam‐1抗原蛋白为免疫原筛选4轮所得的阳性克隆进行单噬菌体ELISA检测，从检测结果中选取9个效价高的克隆经基因测序共获得3个序列，其中1个序列对应的克隆高表达。

表达的单链抗体分子量约30 kD ，ELISA检测其对Vcam‐1抗原蛋白有较高亲和性，效价较单克隆抗体低。

结论利用噬菌体展示技术获得了靶向Vcam‐1的单链抗体，为随后的诊断和治疗应用奠定了基础。

%Objective To screen out single chain variable fragment antibody (scFv)specific to vascular cell adhesion mole‐cule 1(Vcam‐1)from phage recombinant antibody library ,and to evaluateits activity and compare its activity with full‐length monoclonal antibody.Methods Amplification of Vcam‐1 was performed by PCR and Vcam‐1 gene plasmid was transferred into eukaryotic cells to express Vcam‐1 antigen protein.Immune cuvette was coated with purified Vcam‐1 antigen ,and the positive clones were screened out by 4 rounds of“adhesion‐elution‐proliferation” process with gradually increasing pressure.The posi‐tive clones were tested by ELISA method and high titer clones were chosen for gene sequencing.Then the high‐titer clones were transferred into E.coli ,and the clone with the highest expression was regarded as the final requisite petent cells were infected by the final requisite clone and scFv was expressed.After purification ,the activity of scFv was tested by ELISA and its affinity was evaluated.Results Molecular weight of Vcam‐1 antigen protein was 85-90 kD.Positive clones were screened out by taking Vcam‐1 protein as the antigen ,and 9 high titer clones were obtained by single phage ELISA.Gene sequencing of these clones was carried out and 3 sequences were obtained ,1 of which got the highest expression.Molecular weight of the expressed scFv was about 30 kD.The scFv got high affinity to Vcam‐1 antigen according to ELISA ,in spite of its lower activity than full‐length monoclonal antibody.Conclusion scFv antibody specific to Vcam‐1 was successfully obtaine d from phage display librar‐y ,which laid the foundation of subsequent in vivo diagnosis and therapy.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P390-394)【关键词】噬菌体展示;单链抗体;血管细胞黏附分子-1;重组抗体【作者】刘纯宝;宋夷龄;张永学【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022【正文语种】中文【中图分类】R543.1;R541.4抗体是疾病诊断和治疗的重要工具，抗体的制备经历了多克隆、单克隆和基因工程抗体三个阶段。

噬菌体展示文库的筛选技术李丽芳　张映(山西农业大学动物科技学院,太谷　030801)摘　要:　噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PD T )是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。

该技术作为筛选与多种靶分子(如抗体、酶类、细胞表面受体等)具有特异性亲和力或活性的肽的一个有效方法,自问世以来,已取得了很大的发展,并被广泛地应用于基因治疗、基因疫苗研究、抗原表位研究、药物设计、研究细胞信号传导等领域[1]。

但该技术在两方面仍需进一步完善:(1)寻求更为有效的表达载体;(2)进一步完善筛选方法。

关键词:　噬菌体　肽库　抗体库　筛选The Selection T echniques of Phage Display LibrariesLi Lifang Zhang Y ing(A ni mal S cience and Technolog y Depart ment of S hanx i A g ricult ure Universit y ,S hanx i Tai gu 030801)Abstract :　Phage Display Techniques (PD T )is a biotechnique used for screening and reconstructing functingal polypeptide.It ,s a effective method of select the peptide which has high affinities to many given targets (such as an 2tibody ,Enzyme ,surface receptor of cell ).It has been made much progress and are widely used in many fields ,such as genetic treatment ,the study of genetic vaccine ,epitope mapping ,drug discovery after its appearance.But it has to get more perfact in two sides :(1)Seek more effective expression vector ;(2)G et more perfect selection methods.Many selection methods are reviewed in this article.K ey words :　Phage Peptide library Antibody library Selection 噬菌体表面展示技术是一种将外源多肽或蛋白质的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。

噬菌体抗体淘筛方法一、噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术基于噬菌体颗粒表面的基因插入法。

通过将抗体片段的基因插入到噬菌体基因组中，使噬菌体能够在其表面展示抗体。

随后，将含有目标抗原的库经过一系列的筛选步骤，如淘洗、洗涤和分离，以筛选出与目标抗原特异性结合的抗体。

噬菌体核心蛋白质pIII等表面蛋白链通过基因插入的方法与外源基因连接，实现抗原展示。

二、噬菌体抗体淘筛方法的流程1.抗原制备：首先，需要制备目标抗原。

可以通过多种方法制备抗原，如重组蛋白表达系统、细胞和细胞溶解物、组织和分离物等。

2.抗体库构建：构建包含大量抗体片段的抗体库。

一般使用转录组或基因组DNA作为起始材料，使用PCR扩增抗体基因片段，并将其插入合适的载体中。

3.噬菌体包装：将构建好的抗体库与噬菌体粒子一起包装成噬菌体颗粒。

4.抗原吸附：将噬菌体抗体库与目标抗原进行反应，使抗体与抗原结合。

5.淘洗分离：用洗涤缓冲液对混合物进行混洗，以除去非特异性结合的噬菌体。

6.噬菌体放大：将经过淘洗分离的噬菌体在培养基中进行放大培养。

7.ELISA筛选：使用ELISA检测噬菌体是否与目标抗原的特异结合。

将阴性和阳性对照样品和待测样品加入到蛋白质包被的酶标板孔中，通过检测酶标物质的生成或反应物颜色的变化，判断噬菌体是否与目标抗原结合。

8.质粒DNA提取和测序：选择特异性结合抗原的噬菌体进行质粒DNA 提取和测序，以获取抗体的DNA序列。

9.后续鉴定和分析：鉴定筛选出的抗体的亲和力、特异性、敏感性等性质，以及进行进一步的功能分析。

三、噬菌体抗体淘筛方法的注意事项1.抗原的选择：选择合适的抗原非常关键，抗原应具有特异性且容易从培养基或生物样品中提取。

2.抗体库的构建：构建抗体库时，要确保插入的抗体片段多样性和覆盖性。

3.抗原吸附条件的优化：抗原吸附条件的优化对淘洗分离步骤的效果具有重要影响。

4.筛选条件的优化：在ELISA筛选过程中，需要对反应温度、时间、缓冲液浓度等条件进行优化，以提高筛选效果。

噬菌体展示技术名词解释
《噬菌体展示技术》名词解释
《噬菌体展示技术》是一种用于筛选特定目标物的方法，通过利用噬菌体（一种能感染细菌的病毒）展示目标物的方式，实现了高效、快速、可靠的分析和筛选过程。

噬菌体是一种寄生于细菌体内的病毒，它能感染特定的细菌，并在其细胞内进行复制。

噬菌体表面有许多特定的蛋白质，可以与靶物质相互结合。

利用这种特性，科学家们发展了噬菌体展示技术，旨在将所需的特定目标物展示于噬菌体表面，使其能高效结合和筛选出理想的目标物。

在噬菌体展示技术中，首先需要构建一个基因工程噬菌体文库，该文库包含了大量的噬菌体克隆，每个克隆都带有一个外源或随机片段的DNA序列。

这里的DNA序列会与其相应的蛋白
质编码序列连接，从而在噬菌体表面展示目标蛋白。

然后，科学家们通过筛选和鉴定，找到能够与目标物相互结合的噬菌体克隆。

噬菌体展示技术具有许多优势。

首先，由于大量的噬菌体克隆可同时进行筛选，因此可实现高通量的目标物鉴定和筛选。

其次，由于利用噬菌体表面的蛋白质进行展示，所筛选出的目标物会拥有良好的结构和功能，较易于后续研究和开发应用。

此外，噬菌体展示技术还可以应用于抗体库的构建和筛选，可作为研究和开发新药的有力工具。

噬菌体展示技术已成功应用于许多领域，如药物筛选、蛋白质互作研究、抗体工程等。

它为科学家们提供了一个强大的工具，用于快速鉴定和筛选特定目标物，为相关研究和应用提供了有力支持。

总而言之，《噬菌体展示技术》是一种利用噬菌体表面蛋白质展示目标物的筛选方法。

它具有高通量、高效率、高精度等特点，已成为现代生物技术领域中不可或缺的重要工具。

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【摘要】目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6 ×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.%Aim: To construct a human phage-displayed single-chain Fv antibody (ScFv) library and screen specific ScFv against Mycobacterium Smegmatis. Methods: The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients with Mycobacterium Smegmatis, first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo ( dT) -18 primer. To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers, cDNA first strand as a template, were amplified H chain and L chain variable region genes. SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled into ScFv fragments and then cloned into pCANTAB5E ScFv vector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 get Mycobacterium Smegmatis single chain antibody phage display library. Results: A primary library of 3.5 X 106 and a second library of 2.6 x 106 were constructed. Conclusion: The results lay a solid foundation for preparation of human engineeringantibody to Mycobacterium Smegmatis reported herein with higher affinity.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P70-74)【关键词】结核杆菌;人源噬菌体单链抗体;制备及筛选【作者】何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【作者单位】贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起结核病的病原菌，也称结核杆菌.可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见.目前全球约有20亿肺结核带菌者，现症结核患者2 000万，每年有1 000万人新发病和300万人死亡.我国结核患者人数居世界第二位，全国1/3的人口曾受到结核菌的感染［1］.噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势.该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点［2］.本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库，从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础.100 mL外周血来自10例康复1月的结核患者(遵义医学院附属医院检验科提供)，淋巴细胞分离液，购自上海华精生物高科技有限公司.总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司产品;DNA Purification System，Promega，公司产品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司;噬菌粒载体pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coli TG1、HRP/抗M13单克隆抗体，Amersham公司产品;结核杆菌抗原(批号:984010)，购自上海晶莹生物制品公司. 2.1 人源抗体VH和VL基因的PCR扩增以合成的cDNA为模板，VHf和VHr引物等物质的量混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因.VL的PCR反应条件为:95℃预变性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min.VH的退火温度为65℃，其他反应条件同VL.PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段.2.2 ScFv基因的构建通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成ScFv基因.取纯化的VH和VL基因片段经94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35个循环.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收.2.3 噬菌体抗体库的构建将上述PCR产物ScFv纯化回收，用SfiⅠ和NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切的表达载体pCANTAB5E用T4 DNA连接酶，电转化大肠杆菌TG1，铺SOBAG平板.用2×YTAG培养基洗脱菌落，稀释至A600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07继续振摇1 h，离心后用2×YTAK培养基重悬后振摇过夜，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，冰浴，离心，重悬沉淀即为噬菌体ScFv库，过滤后于4℃储存备用.2.4 抗体库的重组率测定、酶切鉴定和多样性分析取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培养基中，37℃，振摇培养至A600=0.68，加入辅助噬菌体M13K07于37℃静置60 min;4℃，3 500×g离心15 min，沉淀重悬于20 mL2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培养过夜;在4℃条件下，8 000×g离心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g离心30 min弃上清，离心管倒置除去PEG液;沉淀用适量的PBS 重悬，移入另一离心管，反复吹打混匀，10 000×g离心5 min，上清即为噬菌体抗体库，检测库容.用SB培养液将所制备的噬菌体抗体库进行10倍系列稀释，分别加入100 μL大肠杆菌TG1(A600=1)，室温下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃过夜培养，次日计数噬菌落形成个数，计算噬菌体抗体库的库容，4℃保存.从SOBAG平板上随机挑取15个单菌落，进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取PCR鉴定为阳性单菌落的质粒，用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱;随机挑取阳性克隆，采用PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱.2.5 噬菌体抗体库的筛选用包被液稀释结核杆菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30g/L BSA的PBS封闭，PBS洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液，以PBST洗涤1次(第2轮洗涤5次，第3～5轮洗涤10次)，PBST洗涤1次，加入100 μL洗脱液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大肠杆菌E.coli TG1，37℃静置20 min，加入20 mL SB(含氨苄西林和四环素)，37℃培养2 h;加入M13K07、卡那霉素.进行5次反复淘洗，收集沉淀.特异性噬菌体抗体得到高度富集.2.6 ScFv的特异性鉴定将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂于SOBAG平板，过夜培养后，随机挑选细菌菌落接种于4 mL含Amp和四环素的SOBAG培养基中，37℃振荡培养过夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振荡培养2 h后加入40 μL M13K07，培养2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振荡培养12～16 h离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存.将待检噬菌体抗体与等量10 g/L BSA混合，室温孵育20 min，加至经抗结核抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗涤2次后，以HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体进行结合反应，TMB显色.3.1 抗体重链和轻链可变区基因的PCR扩增以提取出的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区.产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别在300～400 bp间出现条带，结果见图1.3.2 单链抗体可变区片段(ScFv)的组装和全长扩增采用SOE-PCR的方法将抗体轻、重链可变区基因组装成ScFv片段，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的ScFv基因在700～800 bp间出现条带 (图2).3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定构建的初级抗体库经(库容=涂板后生长出的噬菌斑数数目/涂板菌液量/涂板菌液稀释的倍数)计算，初级库容量为3.5×106.随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，重组率为80%，故次级库的库容量为2.6×106;阳性质粒做双酶切鉴定，电泳示在700～800 bp间出现条带(图3).3.4 抗体库的多样性随机挑取的10个单克隆，经PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4.3.5 噬菌体抗体库的筛选将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选.可以看到随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约110倍，表明噬菌体抗体库得到富集(见表1).3.6 噬菌体ScFv特异性的初步鉴定从第5轮筛选得到的菌落中随机挑选20个克隆，制备噬菌体抗体，经ELISA检测，阳性克隆孔中液体显色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔450 nm时A值为0.076，15株ELISA的A值较高，呈现阳性反应，其450 nm时A值分布于0.256～0.532之间，阳性克隆检出率约为75%.对其中12号阳性克隆的可变区DNA序列和氨基酸进行分析，结果该克隆重链可变区与GenBank中登录的免疫球蛋白IgG重链可变区VH3有92%同源性，κ可变区与V-J4有92%同源性.表明12号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体.噬菌体抗体库技术是采用PCR的方法将B细胞全套可变区基因克隆出来，与噬菌体包膜蛋白融合表达，从而展示于噬菌体表面，即可建成噬菌体抗体库.ScFv的基本结构为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗体分子量只有全抗体的1/6，抗体只有可变区片段，不含恒定区，免疫原性较低，故易于穿过血管壁和组织屏障，没有Fc段，所以减少了与组织的非特异性结合，同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性，具有结构简单，易于大规模生产，成本低等优点，因此在临床、科研、工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景［4-6］.ScFv抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用［7-13］.目前，在多种噬菌体抗体库的构建，并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等单链抗体或Fab抗体［14-17］，有些已进入了临床I/II期试验.人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用［18-20］.抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区(CDR)组成，虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性，但其骨架区的序列和前导序列相对保守，所以抗体可变区PCR引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性.库容量大小影响抗体库质量的最主要因素，而基因的多样性是决定库容量大小，其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体［21］.因为淋巴细胞含目的抗体基因的mRNA是高丰度，有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体，所以选用淋巴细胞建库较好［3］.本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作［3］，通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增出H链和L链可变区基因，将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库，本研究为结核病的预防、诊断、治疗等研究奠定了基础.此研究为结核临床防治研究奠定了基础.【相关文献】［1］吴虢东，王玲.抗结核中药的研究进展［J］.医学综述，2007，13(6):475-476.［2］李菁，林彤，宋帅，等.基因工程重组抗体技术的研究进展［J］.生物技术通报，2009(10):40-44.［3］路艳，韩跃武，韩亚萍，等.抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(11):1063-1067.［4］HUSTON 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抗体筛选技术
抗体筛选技术是一种用于寻找具有特定结合能力的抗体分子的方法。

这些技术可以用于从一个大的抗体库中鉴定出与目标分子高亲和力结合的抗体，并在药物研发、疾病诊断和治疗等领域发挥重要作用。

常用的抗体筛选技术包括：
1. 杂交瘤筛选：将免疫细胞与肿瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，然后通过筛选方法选择出具有特定结合能力的杂交瘤细胞。

2. 单细胞技术：利用单细胞分离和扩增方法，将单个B细胞
分离并扩增，然后进行筛选。

3. 羊抗人技术：将目标抗原注射给动物，然后提取动物的抗体，通过与人类抗体结合的方式筛选出具有特异性的抗体。

4. 购买与筛选：从商业抗体库中购买抗体，然后通过实验验证筛选出具有特定结合能力的抗体分子。

5. Phage display技术：利用噬菌体表面展示抗体库，通过与目
标分子结合筛选出具有高亲和力的抗体。

6. 重组抗体技术：通过基因工程技术构建出具有特定结合能力的重组抗体，然后进行筛选。

这些筛选技术的发展使得科学家能够更高效地寻找和筛选出具有特定结合能力的抗体分子，推动了抗体研究和应用的发展。

抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来,细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。

它从根本上了改变了传统的单抗制备流程(杂交瘤技间接术)，宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。

随着该技术的不断发展,继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术.这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。

抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。

那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库.图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态,根据出现时间的先后,主要分为经典筛选法和新型筛选法。

1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。

固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。

如此反复筛选数次,可得到高亲和性的噬菌体.这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合.2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况,需要开发新的筛选方法。

目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。

细胞筛选法:细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。

噬菌体展示技术解析噬菌体展示技术经过近20年的发展与完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。

噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲与力抗体库。

由于噬菌体展示技术实现了基因型与表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。

另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类与动物疾病有诊断与治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。

应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。

展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构与生物活性，可以与靶分子结合与识别。

噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中与后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

下图粗略展示了技术筛选的过程：二、噬菌体展示系统的分类1.M13噬菌体展示系统M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4 kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ与次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ与PⅨ。

其中，pⅢ与PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ与PⅧ展示系统。

pⅢ蛋白分子量为42 kDa，分布在噬菌体颗粒的一端。

一般一个噬菌体有3-5个拷贝的pⅢ蛋白，可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。

氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟张秀媛;何扩;杜新军;王俊平;杨青【摘要】应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗氧氟沙星单链抗体(scFv)库,筛选获得氧氟沙星特异性噬菌体 scFv 以及同源模拟其三维结构。

将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总 RNA,用 RT-PCR 反转录合成 cDNA,以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,扩增获得 VH 和 VL 可变区基因,通过SOE-PCR法将 VH 基因和 VL 基因通过柔性多肽 Linker (Gly4 Ser)3拼接成全长 scFv 基因片段,将双酶切后的scFv 基因片段插入 T7噬菌体,经体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105 pfu/ mL 的抗体库,经4轮吸附-洗脱-扩增的富集,采用直接竞争 ELISA 筛选到4个特异性噬菌体 scFv,运用 Expasy 软件模拟特异性 scFv 的三维结构。

为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了基础。

%To construct a library of mouse single chain variable fragment (scFv) antibody against ofloxacin using phage display and recombinant antibody technique, specific anti-ofloxacin scFv was screened and 3D structure was homology modeling. Total RNA was extracted from hybridoma cell of ofloxacin mAb, and was used to amplify VH and VL gene by RT-PCR using random primer. Then they were linked by a DNA linker encoding (G1y4 Ser) 3 as VH-linker-VL sequence forming scFv by SOE(splicing by overlap extension) PCR. These fragments were inserted into phage T7 after double digestion and transformed with host bacteria BLT5403. 3 ×105 pfu / ml single chain antibody phage libraries were successfully constructed. Four positive phage scFv clones were screened by direct competitive ELISA after four times of enriched procedure in the order of adsorption-elution-amplificatio, 3D structure of specific scFv was homology modeling finally. This research lays a foundation for further massive expression of anti-ofloxacin scFv.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P829-834)【关键词】氧氟沙星;单链抗体;噬菌体展示;酶联免疫分析【作者】张秀媛;何扩;杜新军;王俊平;杨青【作者单位】河北北方学院，张家口 075000;河北北方学院，张家口 075000; 天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457;天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457;天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457;天津科技大学，教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457【正文语种】中文氧氟沙星(Ofloxacin）为第三代喹诺酮类抗菌药，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有强大的抗菌作用，对厌氧菌和肺炎支原体也有良好作用，广泛应用于畜牧业生产中。

噬菌体展示技术在及其在食品检测上的应用摘要：本文介绍了噬菌体展示技术的原理、分类和筛选方法，综述了噬菌体表面展示技术在检测食品有害小分子物质中的应用，展望这种技术目前存在的不足与今后发展的方向。

关键词：噬菌体展示技术、食品检测1噬菌体展示技术的原理和内容作为一项已广泛运用的技术，噬菌体展示是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术[1]。

它将外源基因插入到噬菌体展示载体的信号肽基因和衣壳蛋白编码基因之间，从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白质形式展示在噬菌体表面，被展示的外源肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性。

与其他表达系统相比，噬菌体展示技术可将基因型和表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，实现了基因型和表型的转换，是一种高效的筛选系统。

噬菌体显示技术主要包括三方面内容(图1)：一是通过DNA重组的方法插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，同时保持外源蛋白的天然构象，不影响噬菌体的生活周期，也能被相应的抗体或受体所识别；二是筛选目的噬菌体，利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出融合噬菌体；三是外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来[2]。

噬菌体亲和筛选的方法包括直接法和间接法，前者是将蛋白质分子偶联到固相支持物上，加入噬菌体肽库，与固相支持物温育，洗去未结合的噬菌体，既获得亲和噬菌体，其中固相支持物有很多，包括树脂、各种尺寸的珠子、96孔板甚至可用于分析的生物传感芯片；后者是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上，洗去未结合的噬菌体，保留结合状态的噬菌体，再洗脱结合的噬菌体，用这部分噬菌体感染细菌，扩增噬菌体，开始新一轮的筛选，通过吸附、洗脱、扩增的重复过程，就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或DNA分子的噬菌体。

噬菌体抗体库技术的流程一、抗体库的构建。

咱先得有个来源去获取抗体基因呀。

这个来源可以多种多样呢，比如说从免疫过的动物或者人的淋巴细胞里获取。

就像是从一个装满宝藏的盒子里找东西一样，要把那些能产生抗体的基因找出来。

然后呢，把这些基因通过一些生物技术手段，像PCR （聚合酶链式反应）这种超级神奇的技术，把它们大量地复制扩增出来。

这就好比是给小种子浇水施肥，让它们变成一大片花海一样。

接着呢，要把这些基因和噬菌体的基因连接起来。

噬菌体就像是一艘小小的飞船，带着抗体基因这个特殊的“乘客”，准备开启一段奇妙的旅程。

二、噬菌体的展示。

构建好的噬菌体抗体库，这时候噬菌体就开始展示自己的“本事”啦。

噬菌体表面有一种特殊的蛋白，就像它的小手臂一样，这个小手臂可以把和它连接的抗体蛋白展示在噬菌体的表面。

这就好像是噬菌体在说：“看呀，我带着这个厉害的抗体蛋白呢！”这个展示的过程很重要哦，就像在舞台上表演一样，要让大家都能看到。

而且这个展示是随机的，每个噬菌体展示的抗体蛋白可能都不太一样，就像每个小朋友画的画都有自己的特色一样。

三、筛选过程。

这可是噬菌体抗体库技术里超级关键的一步呢！我们要找到我们想要的那个噬菌体，就是展示着我们需要的抗体蛋白的噬菌体。

这就像是在一堆沙子里找金子一样困难。

一般会用一种叫抗原的东西来筛选。

抗原就像是一把特殊的钥匙，只有能和它匹配的抗体（也就是展示在噬菌体表面的抗体蛋白）才是我们要找的。

把噬菌体抗体库和抗原放在一起，那些能和抗原结合的噬菌体就会被留下来，其他的就被淘汰掉啦。

这个过程可能要重复好多次呢，就像筛沙子要一遍一遍地筛，才能找到最纯净的金子。

四、鉴定与富集。

筛选出来的噬菌体还不能就这么直接用啦。

我们还得确定一下它们是不是真的就是我们想要的。

这时候就要进行鉴定啦。

可以用各种生物学的方法，像是检测噬菌体的基因序列呀，看看是不是和我们预期的一样。

同时呢，还要把筛选出来的噬菌体进行富集，就是让它们的数量变得更多。

噬菌体展示技术比较与总结噬菌体展示技术是一种基于病毒和细胞表面展示蛋白质、多肽或其他类感受体的高效方法，近年来受到越来越多的关注和研究。

它在疫苗和药物研发、基因工程、蛋白质功能研究等领域中具有广泛应用。

本文将对噬菌体展示技术进行比较与结，探讨其优劣势及未来发展方向。

1.噬菌体展示技术的分类噬菌体展示技术大致可以分为两类：一类是基于基因工程的展示技术，通过将目标蛋白质或多肽基因插入噬菌体的表面蛋白基因中，实现目标蛋白质或多肽的表面展示；另一类是基于晶体学方法的展示技术，该方法通过将目标蛋白质结晶，并在晶体表面进行展示。

两者的原理虽然不同，但均具有较高的展示效率和覆盖面积。

2.基因工程展示技术噬菌体展示技术最主要的应用领域在于蛋白质工程及抗体库筛选等。

基于基因工程的展示技术可以通过将目标蛋白质的基因整合到噬菌体表面蛋白基因中，使得目标蛋白质在噬菌体的表面上得以展示。

噬菌体的生物活性及制备工艺已经得到广泛的研究，提高了蛋白质工程与抗体库的制备效率。

同时，插入基因的过程中，可以将目标蛋白质的结构域进行更改或优化，提高其生物活性与稳定性。

此外，噬菌体插入基因非常容易，只需要简单的操作便可完成，从而提高了实验的可重复性和可拓展性。

3.晶体学方法另一种噬菌体展示技术是基于晶体学方法的展示技术。

该方法主要通过噬菌体溶液或噬菌体核酸复合物的晶体结晶，在晶体表面展示目标蛋白质或多肽。

该方法在克隆目标蛋白质的同时，保护目标蛋白质的原始结构，能够更好地保持蛋白质在晶体结晶过程中的自然构象。

同时，晶体学技术减少了基因工程展示技术中“扭曲”和“失效”现象的产生，增强了对蛋白质结构的保护，提高了研究和发现新型感受体的效率。

4.比较与总结从展示效率角度来看，基于基因工程的噬菌体展示技术能够在同一时间内展示大量的蛋白质或多肽。

而基于晶体学方法的展示技术则更适合在分子结构研究方面进行更为准确的展示。

此外，基于基因工程的噬菌体展示技术相对成本低廉，而基于晶体学方法的展示技术则对可用的技术和设备有更高的要求。

诺贝尔化学奖酶定向进化与噬菌体展示技术一、本文概述本文旨在深入探讨诺贝尔化学奖中提及的酶定向进化与噬菌体展示技术，阐述这两项技术在化学领域的重大贡献及其在现代科学研究中的应用。

酶定向进化是一种通过模拟自然选择过程，对酶分子进行人工改造和优化的技术，旨在提高酶的催化活性、稳定性或选择性。

噬菌体展示技术则是一种利用噬菌体作为载体，将外源蛋白或多肽片段展示在噬菌体表面的生物技术，它在蛋白质相互作用研究、药物筛选和疫苗设计等领域具有广泛应用。

本文将详细介绍这两种技术的原理、发展历程、应用领域以及未来发展趋势，以期为读者提供一个全面而深入的了解。

二、酶定向进化的基本原理与应用酶定向进化是一种强大的生物技术，其基本原理和应用在化学和生物科学领域引起了广泛关注。

这一技术基于达尔文进化论的原理，模拟自然界中生物进化的过程，通过人工选择和优化，实现酶的功能和性能的提升。

酶定向进化的基本原理在于利用突变和重组的方法，产生酶分子的遗传多样性，再通过特定的筛选技术，从中挑选出具有优越性能的突变体。

这一过程模拟了自然选择的过程，但与自然进化相比，其速度和效率大大提高。

突变可以通过随机突变、基因重组或定点突变等方式实现，而筛选则依赖于特定的高通量筛选技术，如荧光激活细胞分选（FACS）、高通量测序等。

酶定向进化在多个领域有着广泛的应用。

在工业生产中，通过酶定向进化，可以开发出更高效、更稳定的工业酶，提高生产效率并降低环境污染。

在医药领域，酶定向进化被用于优化药物代谢酶，以提高药物的疗效和减少副作用。

在环境保护、能源开发等领域，酶定向进化也发挥着重要作用。

值得一提的是，酶定向进化与噬菌体展示技术的结合，为酶的定向进化提供了新的手段。

噬菌体展示技术允许将酶的基因与噬菌体表面蛋白融合表达，从而可以通过与特定底物的亲和性筛选，直接挑选出具有特定功能的酶分子。

这种方法的出现，极大地加速了酶定向进化的速度和效率。

酶定向进化作为一种强大的生物技术，其基本原理和应用在多个领域都展现出了巨大的潜力和价值。