噬菌体抗体库技术

全面解读诺贝尔化学奖之噬菌体展示技术当2018年诺贝尔化学奖颁布的那一刻，我禁不住高呼一声：今年的三大自然科学奖项都被生物学给“收入囊中”了。

别的不说，就说噬菌体展示技术，经过义翘神州十多年的应用改善，已经成为公司抗体制备技术的主要手段，制备开发的抗体近万种，还有几种抗体药物也在临床试验阶段。

为了让大家对噬菌体展示技术有更加清晰的了解，我结合公司十多年的抗体研发生产经验写了本文，希望给大家带来帮助。

1.噬菌体展示技术的发展进化之路1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。

1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为106的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。

而Sir Gregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。

噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。

随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。

然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。

再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

2010.012010.01的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。

与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。

其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。

3噬菌体肽库的筛选技术如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。

经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。

3.1宿主菌直接洗脱经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。

利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。

3.2双层膜筛选系统获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。

通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。

针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。

第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。

细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。

这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。

噬菌体展示文库中的终止密码子噬菌体展示通俗的理解就是把要表达的蛋白与噬菌体的外壳蛋白融合表达，使蛋白表达到噬菌体表面，当然在这个过程中需要保证蛋白的结构和功能不发生改变。

因为蛋白质保持了其本身的活性，所以可以通过特异的反应鉴定筛选出表达有活性蛋白的噬菌体。

该技术将蛋白的表型和基因型直接联系了起来，可以实现高通量的筛选。

噬菌体展示文库可广泛用于选择针对多种不同抗原的抗体。

噬菌体展示抗体（PDA）文库可以快速分离和鉴定用于治疗和诊断的高特异性单克隆抗体。

噬菌体展示抗体文库可以分为免疫库、天然库和随机肽库。

为了创建尽可能大的抗体库，随机肽库越来越受到关注，目前已经产生了很多合成和半合成抗体库。

噬菌体展示抗体文库本质上是一种建库和筛选技术，这里我们重点关注将外源基因插入噬菌体外壳基因，使其表达到噬菌体外壳的建库步骤。

为了在丝状噬菌体表面上显示抗体可变区并随后回收可溶性抗体，将琥珀终止密码子（TAG）置于抗体的编码区和噬菌体外壳蛋白pIII之间。

这种琥珀终止密码子TAG在大肠杆菌抑制菌株如TG1或XL1 blue中表达时，大约20%的时间翻译为谷氨酰胺，而另外80%的时间翻译为终止信号，因此将琥珀终止密码子编码为终止信号的克隆比将琥珀终止密码子编码为谷氨酰胺的克隆的数量更多，也就是说大多数噬菌体并没有将抗体展示到噬菌体表面。

由于只有融合表达外源蛋白和噬菌体衣壳蛋白的噬菌体才有可能被筛选出来，而大多数的翻译终止，所以在抑制菌株中更容易筛选到抗原特异性噬菌体。

一旦选择并克隆了抗原特异性噬菌体，就可以通过转换到大肠杆菌非抑制菌株如HB2151表达可溶性抗体。

然而，从合成和半合成文库中选择阳性结合克隆有一个固有的偏向，即克隆中会含有随机产生的琥珀终止密码子TAG，终止密码子的存在会减缓单链抗体的选择过程，并对单链抗体的分离和生产造成影响，这使得高亲和力结合抗体的鉴定变得复杂。

正常情况下，包含终止密码子的单链抗体比例在10-30%之间波动，但对于某些特定的抗原选择方法，这一比例可能会增加到70-100%。

噬菌体展示技术的原理及应用噬菌体展示技术是一种利用噬菌体作为载体来展示特定蛋白质的方法。

噬菌体是一种只依赖于宿主细胞进行复制的病毒，它具有高度的遗传稳定性和生物安全性，因此成为了生物学研究中常用的工具之一、噬菌体展示技术是通过基因工程手段将目标蛋白的编码序列与噬菌体的外壳蛋白基因连接，从而使得噬菌体表面展示目标蛋白，进而实现其在生物学研究和应用领域的应用。

噬菌体展示技术的原理主要包括四个步骤：构建融合基因、转化宿主细胞、筛选目标蛋白、验证和表征目标蛋白。

首先，需要将目标蛋白的编码序列与噬菌体的外壳蛋白基因连接，形成融合基因。

这一步可以通过PCR技术、DNA重组技术或化学合成等方法完成。

然后，将构建好的融合基因导入到宿主细胞中，使其表达出融合蛋白。

这一步通常通过将噬菌体感染宿主细胞实现。

接下来，通过适当的筛选方法，筛选出表达目标蛋白的噬菌体颗粒。

最后，对得到的目标蛋白进行验证和表征，确认其正确展示在噬菌体表面。

噬菌体展示技术具有广泛的应用。

首先，在蛋白质功能研究方面，噬菌体展示技术可以用来筛选和鉴定蛋白质的结合配体、寻找蛋白质的受体等。

其次，在疫苗研制和药物研发方面，噬菌体展示技术可用于筛选具有特定抗原性的肽段和蛋白质，寻找一些新的抗菌药物和肿瘤治疗靶点。

此外，噬菌体展示技术还能用于表位鉴定、抗体库构建、酶工程等领域。

噬菌体展示技术相对于其他展示技术具有许多优势。

首先，噬菌体是一种非常安全的病毒，不会感染人类和其他动物细胞，具有很高的生物安全性。

其次，噬菌体展示技术可以在宿主细胞内直接进行筛选，与体外筛选相比较省时间和成本，并且能够获得更多的样本选择，增加筛选成功率。

此外，噬菌体展示技术还具有高度的遗传稳定性，可以在不同的生理条件下保持构建好的目标蛋白的稳定表达。

总之，噬菌体展示技术是一种重要的蛋白质展示技术，通过利用噬菌体作为载体，可以实现目标蛋白在噬菌体表面的展示，并在生物学研究和药物研发领域中得到广泛应用。

噬菌体抗体的制备及其在治疗中的应用噬菌体抗体是一种特殊的抗体，它是由噬菌体导致的细胞免疫反应产生的。

噬菌体抗体可以和噬菌体结合，阻止噬菌体的感染，并加速噬菌体的清除。

因此，噬菌体抗体在临床治疗中具有重要的应用价值。

噬菌体的制备噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，它能感染特定的细菌。

噬菌体的制备通常分为两个步骤：感染细菌和收集噬菌体。

感染细菌是制备噬菌体的第一步。

在实验室中，科学家通常使用目标细菌来感染大量的噬菌体。

噬菌体感染后，会在细菌内部复制，最终导致细菌破裂并释放出大量的噬菌体。

收集噬菌体是制备噬菌体的第二步。

科学家可以使用离心技术分离细菌和噬菌体，然后将噬菌体收集起来。

在噬菌体纯化过程中，可以使用各种纯化方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法、超过滤和离子交换层析法，以确保纯化的噬菌体质量和纯度都达到要求。

噬菌体抗体的制备噬菌体抗体是针对噬菌体的特殊抗体。

制备噬菌体抗体的主要步骤包括：免疫动物、采集血清、分离抗体和纯化抗体。

免疫动物是制备噬菌体抗体的第一步。

科学家通常会选择小鼠、兔子或其他动物作为主要免疫对象，然后注射噬菌体制备免疫动物体内。

采集血清是制备噬菌体抗体的第二步。

科学家通常会采集免疫动物的血清，以获得免疫血清中的抗体。

这些抗体可以被用于识别和结合噬菌体，并最终用于治疗。

分离抗体是制备噬菌体抗体的第三步。

科学家通常会使用抗体分离技术，如蛋白A柱层析法、蛋白G柱层析法和酸碱洗脱法，来分离免疫血清中的抗体。

纯化抗体是制备噬菌体抗体的最后一步。

科学家会使用各种纯化技术，如电泳、超过滤和透析等，以去除污染物和提高抗体的纯度。

这样，就可以获得纯净的噬菌体抗体用于治疗。

噬菌体抗体在治疗中的应用噬菌体抗体在临床治疗中具有广泛的应用价值。

在治疗细菌感染、促进免疫调节和治疗自身免疫性疾病等方面均有应用。

治疗细菌感染是噬菌体抗体的主要应用之一。

噬菌体能够感染和破坏特定的细菌，因此对于引起细菌感染的细菌，噬菌体抗体能够用于治疗。

第二章、噬菌体展示技术Phage Display一、噬菌体展示技术 原理基因型 表达型 融合蛋白 PIIILeadHvLinkLvEPIIIM13噬菌体颗粒• M13 particle:4、生活史：• 通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌，或 通过转染进入雌性大肠杆菌细胞； • 进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然 后以滚环方式复制出ssDNA。

• 每当复制出单位长度正链，即被切出和环 化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方 式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。

1M13 life cycle• 性菌毛与Ⅲ作用，衣壳脱去，病毒DNA侵入细菌。

• +DNA转变成双链环状DNA，RFDNA。

Ecoli pol合 成-DNA。

然后进行数轮θ复制。

• 滚环复制：– Ⅱ在RFDNA(+)链的特定位置切割，产生切口，然后 Ecoli polI以-链DNA为模板，在+链DNA的3’OH端延 伸，合成+链DNA。

复制叉移动到终点时，Ⅱ切割产生 一个单位长度的噬菌体基因组DNA，然后环化，再转化 为RFDNA。

作为下一轮复制+DNA和转录的模板。

• 当RFDNA达到100～200拷贝，SSB（ Ⅴ ）抑制Ⅱ 的翻译，并与新合成的+DNA 结合，阻止转化为 RFDNA，也不再合成病毒DNA。

• 包装：形态发生和分泌以协同方式进行。

单链DNA的产生• Producing single-stranded recombinant DNA using M13 and phagemid vectors. • (A) M13 vectors. M13 vectors are replicative (RF) forms of M13 derivatives containing a nonfunctional component of the lacZ b-galactosidase system which can be complemented in function by the presence of a complementary lacZ component in the E. coli JM series. The double-stranded M13 recombinant DNA enters the normal cycle of DNA replication to generate numerous copies of the genome, prior to a switch to production of single-stranded DNA (+ strand only). Mature recombinant phage exit from the cell without lysis. • (B) Phagemid vectors. The pBluescript series of plasmid vectors contain two origins of replication: a normal one from ColE1 and a second from phage f1 which, in the presence of a filamentous phage genome, will specify production of single-stranded DNA. Superinfection of transformed cells with M13 phage results in two types of phage-like particles released from the cells: the original superinfecting phage and the plasmid recombinants within a phage protein coat. Sequencing primers specific for the phagemid vector are used to obtain unambiguous sequences. Abbreviation: MCS, multiple cloning site.2f1噬菌体文库筛选• Phage display. • Phage display is a form of expression cloning which involves cloning cDNA into phage vectors and expressing foreign proteins on the phage surface. The figure illustrates one popular approach whereby the DNA is cloned into gene III of the filamentous phage f1 (or M13, etc.), a gene which encodes a minor phage coat protein. The cloning site is usually designed by site-specific mutagenesis to occur at a position corresponding to the extreme N-terminal sequence of the gene III protein. Following transfection of E. coli, phage assembly, extrusion from the cells and phage harvesting (see Figure 4.17 for the general scheme of cloning using filamentous phage vectors), a phage library is produced. • Recombinants with inserts which do not produce a frameshift in the reading frame may often be expressed to give a fusion protein in which the N-terminal component consists of a foreign protein sequence. An antibody which specifically recognizes one of the foreign protein sequences can then be used to bind specifically to the phage which displays the sequence, leading to its purification. Such affinity purification permits identification of cDNA sequences encoding an uncharacterized protein of interest。