实验三_碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。

二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。

可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点，
在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作

实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。

2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。

3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。

实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。

在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。

实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。

- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。

2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。

- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。

- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。

3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。

- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。

实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。

2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。

1．原理
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3
2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
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1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
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（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
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(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 底物终浓度[S] (mM )
1
23
4
5
0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水（mL ）
0.5 0.45 0.4 0.3 0
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五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号
0 12 3 4 5 6