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碱性磷酸酶米氏常数的测定

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碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定碱性磷酸酶的分离纯化及⽐活性与⽶⽒常数测定⼀、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP(2).⽐活性测定1.⽐活性的定义*单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。

*通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。

*⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之⼀。

2.测定样品的⽐活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。

3.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).⽶⽒常数测定K m即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊如上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度,因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。

⼆. 器材721分光光度计台式离⼼机恒温⽔浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏⽔稀释⾄100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%⼄醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,⽤蒸馏⽔溶解成50ml,为0.1mol/L Tris 液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏⽔80ml,再⽤1%醋酸调pH⾄8.8,然后⽤蒸馏⽔稀释⾄100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯⼆钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替⽐林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏⽔中;两液混合并蒸馏⽔稀释⾄50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕⾊瓶中,冰箱内保存,可⽤⼀星期;临⽤时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取⽆⽔碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏⽔,稀释⾄50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏⽔⾄100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏⽔中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏⽔⾄50ml,置棕⾊瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏⽔中,稀释⾄10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶⽐活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5⽀试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空⽩各阶段稀释液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 - -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- - 0.1 -pH8.8Tris缓冲液(ml) - - - - - 0.1置37℃⽔浴中保温5分钟复合基质液(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀,37℃⽔浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管⽴即加⼊1.0ml碱性溶液终⽌反应,再加⼊0.5%铁氰化物钾2.0ml,⽴即混匀,静置10min,在510nm波长下⽐⾊测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准OD X标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋⽩质含量的测定(1)测定蛋⽩质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋⽩质浓度太⾼,其余各管不需再稀释,各⽤1.0ml进⾏测定.表2A’’B’C’D’空⽩各阶段稀释液(ml) 1.01.01.01.0 -0.1mg/ml酚标准液(ml) - -- -1.0pH8.8Tris缓冲液(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀,置20~25℃⽔浴中保温10分钟复合基质液(ml) 0.50.50.50.50.5(2)⽴即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处⽐⾊.(3)蛋⽩质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋⽩质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋⽩质毫克数.4.⽐活性及得率计算碱性磷酸酶⽐活性=每毫升样品中碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋⽩质毫克数纯化倍数=各阶段⽐活性数/匀浆(A液)⽐活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实验计算结果填⼊表3内.表3分离总体积蛋⽩质总蛋⽩每毫升酶总活性⽐活性纯化得率阶段(ml) 浓度(mg) 活性单位单位(U/mg ) 倍数(%)(mg/ml) (U/ml) (U)匀浆(A液)第⼀次丙酮沉淀(B液)第⼆次丙酮沉淀(C液)第三次丙酮沉淀(D液)3．⽶⽒常数测定1. 取15只试管，按照下表操作，1～7号重复两组，0 号为空⽩对照。

实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定

实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
即当V=Vmax/2时，Km=[S]
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃Байду номын сангаас温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.5％ 铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
四、实验步骤
一． 酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定
精品课件
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
精品课件
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴 截距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶Km值的 测定
精品课件
【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测 定的原理和方法
精品课件
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
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【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
精品课件
1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
精品课件
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-
苯
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
6
78

碱性磷酸酶km值测定实验报告

碱性磷酸酶km值测定实验报告

碱性磷酸酶km值测定实验报告碱性磷酸酶 Km 值测定实验报告一、实验目的1、掌握测定碱性磷酸酶（ALP）Km 值的原理和方法。

2、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。

3、熟悉分光光度计的使用。

二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛分布于人体各脏器器官中的酶，在骨、肝、肠、胎盘等组织中含量较高。

它能催化磷酸酯的水解反应，产生无机磷酸和醇、酚等物质。

在酶促反应中，反应速度（v）与底物浓度S之间的关系可用米氏方程表示：v ＝ VmaxS ／（Km ＋ S) ，其中 Vmax 为最大反应速度，Km 为米氏常数。

Km 值是酶的一个重要特征常数，它表示酶与底物的亲和力。

Km 值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，Km 值越大，酶与底物的亲和力越小。

本实验通过测定不同底物浓度下的酶促反应速度，以反应速度 v 对底物浓度S作图，通过双倒数作图法（LineweaverBurk 作图法），即1/v 对 1/S作图，可求得碱性磷酸酶的 Km 值。

三、实验材料与仪器1、材料碱性磷酸酶提取液磷酸苯二钠溶液（不同浓度）01mol/L 氢氧化钠溶液004mol/L 碳酸钠溶液05mol/L 三氯乙酸溶液2、仪器分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、准备试剂配制不同浓度的磷酸苯二钠溶液：0005mol/L、001mol/L、002mol/L、003mol/L、004mol/L。

配制显色剂：将 01mol/L 氢氧化钠溶液和 004mol/L 碳酸钠溶液按4:1 的体积比混合。

2、反应体系设置取 7 支干净的试管，按下表加入试剂：｜试管编号|1|2|3|4|5|6|7|｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜磷酸苯二钠溶液（mL）｜000|020|040|060|080|100|＿____|｜蒸馏水（mL）｜100|080|060|040|020|000|＿____|｜37℃预温5min 后，各加入05mL 碱性磷酸酶提取液，立即混匀，37℃水浴准确反应 15min|｜反应结束后，各加入 05mL 05mol/L 三氯乙酸溶液终止反应|3、显色与比色各管加入 45mL 显色剂，充分摇匀。

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定

1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0Leabharlann 2.02.02.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 8 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90 0.95 0.85
0.90 0.90 0.75 0.70
0.90 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S] + 1/ Vmax

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法

将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。

碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-

碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-

12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定

6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
历史ⅱ岳麓版第13课交通与通讯 的变化资料
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[自读教材·填要点]
一、铁路，更多的铁路 1．地位 铁路是 交通建运设输的重点，便于国计民生，成为国民经济 发展的动脉。 2．出现 1881年，中国自建的第一条铁路——唐山 至开胥平各庄铁 路建成通车。 1888年，宫廷专用铁路落成。
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和 磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧 化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O
AKP OH-
苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事
业是
()
A．电报业
B．大众报业
C．铁路交通业 D．轮船航运业
[解析] 材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。
[答案] A
[题组冲关]
3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信
息，可采用的最快捷的方式是
()
A．乘坐飞机赴各地了解 B．通过无线电报输送讯息
C．通过互联网 D．乘坐火车赴各地了解
解析：本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信
息“20世纪初”“最快捷的方式”，因此应选B，火车速度 远不及电报快。20世纪30年代民航飞机才在中国出现， 互联网出现在20世纪90年代。 答案：B
4．下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是( ) A．信息传递快捷简便 B．改变着人们的思想观念 C．阻碍了人们的感情交流 D．影响着人们的社会生活 解析：新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。 答案：C

米氏常数的测定

米氏常数的测定

二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。

0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量?mol数计算出各种底物浓度下的初速度vo单位以?mol?l1?min1表示取倒数1v填入表内
实验九 碱性磷酸酶米氏常 数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
四、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 管 号 0 1 0.1 0.7 2 0.2 0.6
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm

实验碱性磷酸酶米氏常数的测定

实验碱性磷酸酶米氏常数的测定
1．原理
医学课件ppt
3
2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
医学课件ppt
4
1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
医学课件ppt
5
（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
医学课件ppt
21
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
医学课件ppt
20
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 底物终浓度[S] (mM )
1
23
4
5
0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水（mL ）
0.5 0.45 0.4 0.3 0
16
医学课件ppt
返回17
医学课件ppt
返回18
医学课件ppt
返回19
五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号
0 12 3 4 5 6

5碱性磷酸酶米氏常数的测定全解

5碱性磷酸酶米氏常数的测定全解

0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
实验九 碱性磷酸酶米氏常 数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
No. 底物终浓度[S] (mM ) 10 mmol/L pNPP（mL ） 蒸馏水（mL ） 碳酸盐缓冲液（mL ） 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 预热 酶液（mL ） 反应时间 0.1 mol/L NaOH（mL） 酶液（mL ） OD405 1 2 3 4 0.5 0.75 1.0 1.5 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 0.45 0.4 0.3 各加1.0 mL 各加0.2 mL 混匀，37℃，5分钟 测定管各加0.2 mL酶液 37℃，精确反应10分钟 各加2 mL 空白管各补加0.2 mL酶液 5 3 0.6 0
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)

米氏常数的测定

米氏常数的测定

从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量mol数计算出各种底物浓度下的初速度vo单位以mol?l1?min1表示取倒数1v填入表内
实验九 碱性磷酸酶米氏常 数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
四、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 管 号 0 1 0.1 0.7 2 0.2 0.6
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的测定
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【实验目的】
了解酶的Km值测定 原理和方法
掌握碱性磷酸酶 （AKP）活性测定的 原理和方法
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反 应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但 当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度 趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度 与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示， 即：
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为空白， 于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录
1
2
3
4
5
7
8
6
OD
底物浓度 1
比较两个值的 差异.
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
【实验讨论】
01
02
比较两个值的大小,分析实验误 差产生的原因
比较两种Km测定方法各自的 优缺点
1
Vmax•[S]
2
V=
3
Km + [S] 其中Km为米氏 常数，
4
Vmax为最大反 应速度， 当V=Vmax/2 时，则Km=[s]。
5
Km是酶的特征常 数，测定Km是研 究酶的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以 l/ v－1／[s]作图，将各点连线， 在横轴截距为-／km，据此可算出 Km值。

米氏常数的测定

米氏常数的测定

（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。

0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
五、 注意事项
1.
2.
3. 4. 5. 6.
7.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用
六、思考题 (1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学 意义。 (2)为什么说米氏常数Km 是酶的一个特征常 数而Vm则不是？
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即：

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定(优选参考)

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定(优选参考)

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。

二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。

碱性磷酸酶米氏常数测定

碱性磷酸酶米氏常数测定

碱性磷酸酶米氏常数测定P60【实验原理】在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时，酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。

若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。

当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图所示。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。

V = V max[S]/(K m+[S])上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。

当V= V max/2时，K m=[S]。

所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。

因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。

K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。

酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。

林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m值，如图所示。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。

可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

【微生物学】第二次实验课：碱性磷酸酶米氏常数的测定,血清转氨酶活性测定(2016-03-10)

【微生物学】第二次实验课：碱性磷酸酶米氏常数的测定,血清转氨酶活性测定(2016-03-10)

n 血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预 后的指标之一。
二．实验原理
• 谷丙转氨酶（glutamination pyruvic transaminnse, GPT）,又称丙氨酸氨基转移酶（alamine aminotransferase,ALT）,作用于L-丙氨酸和 α–酮戊 二酸之间的氨基转移作用，其反应式如下：
• 酶活性的测定结果与温度、酶作用的时间、试剂加入 量等有关，操作时应严格掌握。
• 2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反应并不是特异的，α– 酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而显色，此外， 2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色，因此空白颜色较 深。
• 当测定结果超过150卡门氏单位时，应用生理盐水稀释 后再测。
1. 物质的颜色和波长：
可见光：波长（λ）400—760nm
紫外光：λ小于400nm
红外光：λ大于760nm
2. 溶液的颜色和光吸收的关系：
光的互补示意图
溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜 色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相 互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。
（三）利用吸收光谱对物质进行定量分析
1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射
光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光
程的厚度
2．常用方法 （1）标准曲线法
OD或Ａ
浓度 • 标准曲线与样品的测定条件必须一致。
α-酮戊二酸
COOH CH2 CHNH2 COOH 天冬氨酸
正常人各组织中ALT及AST 活性 (单位/克湿组织)
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碱性磷酸酶米氏常数的测定
[目的与要求]
通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。

学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。

[原理]
在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。

酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。

酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。

若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。

当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。

V = V max[S]/(K m+[S])
上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。

当V= V max/2时，K m =[S]。

所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。

因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。

K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。

酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。

林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：
1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成
一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。

图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。

可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。

反应式如下：
[操作步骤]
1．底物浓度对酶促反应速度的影响
（1）取6支试管，作好标记。

按下表操作。

试剂（mL）管号
1 2 3 4 5 6
0.04mol/L 基质液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0
pH10，0.1mol/L碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70
蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴中保温5分钟
血清 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00
(2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15 分钟。

(3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。

(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林1.OmL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。

(5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出K m值。

2. 酚标准曲线的绘制
（1）取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。

试剂（mL） 1 2 3 4 5 6
0.1mg/mL 酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴保温5min
碱性溶液 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
(2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。

(3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。

[结果与计算]
在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可算出酶活性。

100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100×（1/1000）
[注意事项]
1．血清取量要准确
2．标准曲线必须是过原点的一条直线
[试剂]
1．0.04mol/L 基质液称取磷酸苯二钠10.16g或无水磷酸苯二钠8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并定容至1000mL，加入4mL氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一周。

2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

3．碱性溶液取0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaHC03各20mL，混合后加蒸馏水到100mL。

4．0.5％铁氰化钾取铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400mL蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶中，暗处保存。

5．0.3％ 4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及NaHC034.2g用蒸馏水溶解，并稀释至100mL，置棕色瓶中，4℃保存。

6．酚标准液(0.1mg/mL)
a．称取结晶酚1.50g，溶于0.1mol／L HCl，定容至1000mL为贮备液。

b标定：取25mL上述贮备液，加0.1mol／L NaOH 55mL，加热至65℃。

再加入0.1mol/L 碘液25.0mL，盖好放置30分钟，加浓HCl 5mL，再以0.1％淀粉作指示剂，用0.1mol／L 硫代硫酸钠滴定，反应如下：
3I2 + C6H5OH C6H2I3OH + 3HI
I2 +2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6
根据反应，3分子碘(Mw：254)与一分子酚(Mw：94)起作用，因此每毫升0.1mol/L碘液(含碘12.7mg)相当于酚的毫克数为 12.7×94/（3×254）=1.567
25mL碘液中被硫代硫酸钠滴定者为xmL，则25mL酚溶液中所含酚量为：1.567mg×（25-x）。

c. 应用时，按标定结果用蒸馏水稀释至0.1mg／mL作为标准液。

[器材]
1．37℃水浴 2．可见光分光光度计。