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碱性磷酸酶Km值的测定课件

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碱性磷酸酶Km值的 ppt课件

碱性磷酸酶Km值的 ppt课件
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
6
7
9:02:30 9:03:00
碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]

碱性磷酸酶Km值的ppt课件

碱性磷酸酶Km值的ppt课件

精选课件
10
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1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
9:00:00 9:00:30 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00
9:01:30 9:16:30
9:02:00 9:17:00
6
7
9:02:30 9:03:00
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
精选课件
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
精选课件
9
注意事项
• 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]
• 2 可电脑作图
• 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16)
• 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终 必须得出结论：Km值等于多少
碱性磷酸酶Km值的测定
精选课件
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
精选课件
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
精选课件
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
精选课件
5
V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vmax[S]

酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定

酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定

碱性磷酸酶液
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -
混匀后，370C水浴 15 min（准确计时）
酚试剂
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
碱性磷酸酶液
- - - - - - - 0.1
10％ Na2CO3
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶酚 NaFra bibliotekHPO4pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
酶促反应动力学 实验
影响酶促反应速度的因素
酶浓度 B
温度 C
底物 浓度
A
酶促反 应速度
D pH值
F 抑制剂
E 激活剂
酶浓度对反应速度的影响
底物浓度 >酶浓度

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定
精品课件
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
精品课件
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴 截距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶Km值的 测定
精品课件
【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测 定的原理和方法
精品课件
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
精品课件
【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
精品课件
1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
精品课件
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-
苯
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
6
78

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定

1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0Leabharlann 2.02.02.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 8 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90 0.95 0.85
0.90 0.90 0.75 0.70
0.90 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S] + 1/ Vmax

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法

将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。

酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT

酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT

可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点，
在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作

碱性磷酸酶Km值测定

V Vmax
[S]
Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时 V
Vmax
Vmax/2 Km [S]
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(LineweaverBurk)作图法
Байду номын сангаас 三、操作方法
参见实验讲义
四、思考题
1.测定Km值还有哪些方法？ 2.测定Km值有何实际意义？
V= Vmax[S]
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
本实验以碱性磷酸酶为样品： 碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷 酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作 用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物， 根据红色的深浅可测出酶活力的高低，测 定不同浓度底物时的酶活性。
碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物根据红色的深浅可测出酶活力的高低测定不同浓度底物时的酶活性
碱性磷酸酶Km值测定
一、实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米孟方程、Km值的物理意义及双 倒数作图求Km的方法。
二、实验原理

酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定


米氏常数Km：描述酶与 底物亲和力的常数
底物浓度与反应速率的关 系：底物浓度越高反应速 率越快
酶浓度与反应速率的关系： 酶浓度越高反应速率越快
温度与反应速率的关系： 温度越高反应速率越快
pH值与反应速率的关系： pH值影响酶的活性从而 影响反应速率
Km值的含义与计算方法
Km值：酶促反应中酶的活性与底物浓度的比值表示酶与底物的亲和力 计算方法：通过酶促反应速率与底物浓度的关系曲线利用米氏方程计算得出 Km值的意义：反映酶与底物的亲和力是酶学研究中的重要参数 Km值的应用：在药物设计、酶工程等领域具有重要应用价值
• 实验目的：测定碱性磷酸酶的Km值
• 实验原理：通过酶促反应动力学原理测定酶的活性和底物浓度的关系
• 实验步骤： . 准备实验材料：酶、底物、缓冲液等 b. 设定反应条件：温度、pH值、反应时间等 c. 测定酶活性：通 过酶促反应速率测定酶活性 d. 测定底物浓度：通过酶促反应速率测定底物浓度 e. 计算Km值：通过酶促反应速率和 底物浓度的关系计算Km值
配制反应溶液：按照实 验要求配制反应溶液包 括酶促反应试剂、碱性
磷酸酶、缓冲液等
加入底物：在反应容器 中加入底物并记录底物
浓度
加入酶促反应试剂：在 反应容器中加入酶促反 应试剂并记录酶促反应
试剂浓度
反应开始：在反应容器 中加入碱性磷酸酶并记
录碱性磷酸酶浓度
反应结束：反应进行一 段时间后记录反应时间、
06
实验结论与展望
实验结论总结
实验结果表明碱性 磷酸酶Km值与酶 促反应动力学密切 相关
实验数据表明碱性 磷酸酶Km值在不 同条件下的变化规 律
实验结果对于理解 酶促反应动力学具 有重要意义

碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定
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【实验目的】
了解酶的Km值测定 原理和方法
掌握碱性磷酸酶 （AKP）活性测定的 原理和方法
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反 应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但 当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度 趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度 与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示， 即：
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为空白， 于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录
1
2
3
4
5
7
8
6
OD
底物浓度 1
比较两个值的 差异.
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
【实验讨论】
01
02
比较两个值的大小,分析实验误 差产生的原因
比较两种Km测定方法各自的 优缺点
1
Vmax•[S]
2
V=
3
Km + [S] 其中Km为米氏 常数，
4
Vmax为最大反 应速度， 当V=Vmax/2 时，则Km=[s]。
5
Km是酶的特征常 数，测定Km是研 究酶的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以 l/ v－1／[s]作图，将各点连线， 在横轴截距为-／km，据此可算出 Km值。

碱性磷酸酶km值测定PPT课件

实验目的
• 学习环境因素对酶促反应速度的影响； • 学习米氏方程及Km值得测定； • 测量碱性磷酸酶km值；
实验原理
E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等
•1
相关E学原理 （一）米－曼氏方程式
酶促反应模式——中间产物学说
E+S
k1 ES k3 E + P
Km/Vm
-Km
[S]
•8
酶浓度对反应速度的影响
V
➢当 [S] ＞ ＞ [E] ， 酶 可 被 底物饱和的情况下，反 应速度与酶浓度成正比。
➢关系式为：V = K3 [E]
0
[E]
当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响
•9
温度对反应速度的影响
双重影响
温度升高，酶促反应速度 升高；由于酶的本质是蛋白质， 温度升高，可引起酶的变性，从 而反应速度降低 。
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
•3
❖ Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时
V Vmax Vmax/2
Km
Vmax 2
＝ Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半
时的底物浓度，单位是mol/L。
•4
（二）Km与Vmax的意义
酶 2.0
活 性 1.5
最适温度 (optimum temperature)：
酶促反应速度最快时的 环境温度。
* 低温的应用
1.0
0.5
0 10 20 30 40 50 60
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碱性磷酸酶Km值的 测定
碱性磷酸酶Km值的测定
1
【实验目的】
•1.了解酶的Km值测定原理和方法
• 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理 和方法
碱性磷酸酶Km值的测定
2
【实验原理】
• 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速 度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应 速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来 表示，即：
碱性磷酸酶Km值的测定
9
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 1 2 3 4
5
OD
底物浓度 1 3 5 6 8 mmol/L
6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
碱性磷酸酶Km值的测定
10
2、作图
• 以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观察曲线形状； 查Km 值
碱性磷酸酶Km值的测定
8
碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 2.0 2.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
碱性磷酸酶Km值的测定
3
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
碱性磷酸酶Km值的测定
4
• 将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
苯酚+4-氨基安替比林
K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
碱性磷酸酶Km值的测定
6
【实验操作】
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M)
碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90
0.90 0.90
0.90
• 比较两种Km测定方法各自的优缺点
碱性磷酸酶Km值的测定
13
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碱性磷酸酶Km值的测定
14
0.90 0.90
0.90
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
混匀后37℃水浴，预温5分钟左右
碱性磷酸酶Km值的测定
7
酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴）， 反应开始。
从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应，各管反应时间应准确一 致，为15分钟。
• 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图，观察 曲线形状；查Km 值
• 比较两个值的差异.
碱性磷酸酶Km值的测定
11
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱVmax
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
[S]
-1/Km
双倒数曲线
碱性磷酸酶Km值的测定
1/[s]
12
【实验讨论】
• 比较两个值的大小,分析实验误差产生的原 因
• 1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
碱性磷酸酶Km值的测定
5
• 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生 成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用， 经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅 可测出酶活力高低。其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚