Cdc42-shRNA表达载体的构建及在肝癌细胞株的沉默效果

shRNA实验成功不得不看的shrna 设计原则大总结RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。

其中shrna设计在慢病毒的构建上应用颇广，本文对shRNA设计原则和操作技巧进行介绍。

1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环( [shRNA shrna 设计原则寡核苷酸酶切位点聚合酶]RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。

其中shrna设计在慢病毒的构建上应用颇广，本文对shRNA设计原则和操作技巧进行介绍。

1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。

随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

3.StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。

6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。

不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。

其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。

在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(AMBION use)。

7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。

8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。

这可能导致shRNA转录的提前终止。

9.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

Cdc42小干扰RNA对结肠癌细胞恶性表型的影响刘素蕊;张思源;刘明;朱亚杰;周继陶;黄娟;唐秋琳;陈向征;郎楠;毕锋【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2009()12【摘要】目的研究细胞周期分裂蛋白Cell divisioncy cle42(Cdc42)小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌细胞恶性表型的影响.方法Western blot检测五种结肠癌细胞系中Cdc42的表达。

设计并合成靶向Cdc42编码区的三对siRNA及阴性对照RNA,应用LipofectamineTM2000分别转染结肠癌细胞系中高表达Cdc42的Lovo和SW620细胞,RT-PCR和Western-blot分别检测48h后Cdc42mRNA 及蛋白的表达。

Cell Counting Kit-8检测细胞的增殖能力,损伤刮擦实验和Transwell小室法分别检测细胞迁移与侵袭能力的变化。

结果RT-PCR和Western blot检测显示,Cdc42-siRNA能显著下调Cdc42mR-NA和蛋白水平,尤其Cdc42-siRNA1;siRNA处理后的肿瘤细胞增殖受到抑制,细胞迁移、侵袭能力也显著降低。

结论Cdc42-siRNA可有效抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

提示Cdc42可能成为抑制结肠癌细胞增殖和转移新的分子靶点。

【总页数】4页(P1016-1019)【关键词】结肠癌;Cdc42;Rho;siRNA【作者】刘素蕊;张思源;刘明;朱亚杰;周继陶;黄娟;唐秋琳;陈向征;郎楠;毕锋【作者单位】四川大学生物治疗国家重点实验室/信号转导及分子靶向治疗研究室;华西医院腹部肿瘤科【正文语种】中文【中图分类】R735.35;R73-35【相关文献】1.靶向survivin的小干扰RNA对HCCLM6细胞恶性表型的影响 [J], 韩丹;叶胜龙;刘彬彬;陈荣新;薛同春;孙瑞霞;赵燕;陈洁2.小干扰RNA沉默结肠癌转移相关基因1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响[J], 陈喜全;王红雷;尚闯3.微小RNA-196a在结肠癌组织中表达及小干扰RNA沉默对结肠癌细胞侵袭和转移的影响 [J], 张健;李亚兰;韩广森;蒋志强;王道海4.小干扰RNA沉默赖氨酸去甲基化酶2A对结肠癌细胞增殖及侵袭能力的影响 [J], 谢二娟;李海杰;罗学来;方华5.Tspan8在结肠癌细胞中的表达及小干扰RNA干扰后对SW620细胞功能的影响 [J], 任宇鹏;宋纯;孟庆凯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响大连医科大学博士学位论文shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的景程姓名：李荣宽申请学位级别：博士专业：病理与病理生理学指导教师：唐建武201006shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca．F生物学行为的影响博士研究生：李荣宽指导教师：唐建武教授专业名称：病理学与病理生理学摘要背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。

对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。

原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类型，其中90％以上为肝细胞癌。

全世界每年新发约62．6万例HCC患者，其中的半数以上病例发生在我国。

同时，它也是恶性程度最高、致死率最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第二位。

即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％，因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降低死亡率的目的。

Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。

其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。

通过对比研究二者的差异，可以为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。

整合蛋白β1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响张振中; 张炜炜; 杨春霞; 朱珠; 傅奕【期刊名称】《《实用临床医药杂志》》【年(卷),期】2010(014)010【摘要】目的应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。

方法设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒。

经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721,Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达,MTT方法测定转染后细胞的增殖能力。

结果成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制,p27的蛋白表达也随之减少。

MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高。

结论应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达。

整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关。

【总页数】5页(P12-16)【作者】张振中; 张炜炜; 杨春霞; 朱珠; 傅奕【作者单位】^p【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.整合蛋白β1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响[J], 张振中;张炜炜;杨春霞;朱珠;傅奕2.ATX-shRNA表达质粒对肝癌细胞体外增殖和运动能力的影响 [J], 谢应海;刘斌;王爱民;李安全;钟伟3.人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响 [J], 陆彬彬;殷咏梅;王朝霞;王腾;德伟;束永前4.融合蛋白SMP30-IP10真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞迁移、侵袭、增殖的影响 [J], 谢美玉;郭顺利;宾晓芸;石明霞;陈安宁;陈思宇;周素芳5.shRNA下调Paxillin表达对SMMC-7721肝癌细胞增殖、侵袭的影响 [J], 王波;金雯;杨梅;罗雪莲;朱治文;查诚;曹立宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。