分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立

肝癌分原发性和继发性两种，继发性肝癌系由于其它脏器的肿瘤经血液、淋巴或直接侵袭到肝脏所致。

原发性肝癌可分为肝细胞型，胆管细胞型和混合型三种类型，其中绝大多数为肝细胞型。

原发性肝癌为我国常见恶性肿瘤之一。

死亡率在恶性肿瘤中居第三位，仅次于胃癌和食管癌。

流行病学调查，肝癌的病死率地理差别很大。

据世界卫生组织统计，在世界范围内肝癌死亡率列第五位。

我国普查每十万人口中有14.58~46人发病，以江苏启东和广西扶绥的发病率最高。

值得注意的是世界各地原发性肝癌发病率都有上升趋势，每年约有25万人死于此病，其中约40%发生在中国，这可能与肝炎病毒感染有关。

近年来我国关于肝癌的防治研究取得了重大的进展。

亚临床肝细胞癌及小肝癌的发现日益增多，上海医科大学中山医院资料，小肝癌手术切除后5年生存率达69.4%。

在世界上处于领先地位。

亚临床肝癌这一概念的提出不但反映了对肝细胞癌理论认识上有新转变，也促进了治疗上的重大进展。

本病可发生于任何年龄，以40~49岁为多，男女之比为3~5∶1。

病因及发病机理原发性肝癌的病因与发病原理迄今尚未确定。

多认为与多种因素综合作用有关，近年来研究着重于乙型、丙型肝炎病毒，黄曲霉毒素及其它化学致癌物质。

一、病毒性肝炎临床上原发性肝癌患者约三分之一有慢性肝炎史。

国内普查发现原发性肝癌高发区肝炎发病率也高。

流行病学调查发现肝癌高发区人群的HBsAg阳性率较低发区为高，而肝癌患者血清HBsAg阳性率又显著高于健康人群。

病理学发现肝癌合并肝硬化多为结节性肝硬化。

后者与肝炎密切相关。

近年来用地衣红染色等方法显示肝癌细胞中有HBsAg存在，另外也证实HBV(乙型肝炎病毒)可整合到宿主肝细胞的DNA中，还建立了能产生HBsAg 的人肝癌细胞株。

以上事实说明乙型病毒性肝炎与肝癌之间有一定的因果关系。

近年来研究过去所谓的非甲非乙型肝炎，现定名丙型肝炎，对人类的威胁较乙型肝炎更为严重，与肝硬化肝癌的关系更密切。

木犀草素、黄芩苷和大黄素对肝癌自杀基因治疗旁杀伤的增效作用的开题报告一、研究背景和意义肝癌是全球范围内生命威胁非常严重的一种恶性肿瘤，临床治疗效果并不理想。

基因治疗作为一种新兴治疗方式，在近年来取得了不少进展。

然而，肝癌细胞存在着自杀基因的异常表达，阻碍了肝癌基因治疗的有效实施。

因此，寻找肝癌自杀基因治疗的增效剂是当前肝癌治疗研究的短板之一。

近年来，许多研究表明，植物中的活性成分具有抗肿瘤作用，具有较好的治疗肝癌的潜力。

例如，木犀草素、黄芩苷和大黄素具有抗肿瘤和免疫调节作用，并且已经广泛应用于肿瘤治疗。

因此，本文将研究这三种化合物对肝癌基因治疗的增效作用。

二、研究目的本研究旨在通过实验研究探究木犀草素、黄芩苷和大黄素在肝癌自杀基因治疗旁增效作用中的机制，为肝癌治疗提供新的思路和方法。

三、研究内容本研究将分为以下几个方面：（1）建立肝癌细胞株本研究将选取具有高表达自杀基因的肝癌细胞株（如HepG2和SNU-398），培养并实施基因治疗。

（2）制备三种化合物本研究将从天然植物中分离提取木犀草素、黄芩苷和大黄素。

（3）化合物的增效作用将肝癌细胞株分为基因治疗组、化合物组和基因治疗加化合物组。

取细胞进行MTT实验、流式细胞术检测和Western blot检测。

（4）机制研究研究化合物对p53及其下游信号通路的影响。

四、研究预期本研究将探索木犀草素、黄芩苷和大黄素在肝癌自杀基因治疗中的增效作用及其机制，确定这三种化合物对自杀基因的影响和作用靶标。

通过本实验，为肝癌治疗提供新的治疗思路和方法，为开发肝癌的治疗药物提供理论依据。

共识.中华肝脏病杂志,2004,12∶425～42811　Perrillo RP ,Lai CL ,Liaw YF ,et al .Predictors of HBeAg loss afterlamivudine treatment for chronic hepatitis B .Hepatotogy ,2002,36∶186～19412　Rizzetto M ,Tassopoulos NC ,Goldin RD ,et al .Extended lamivu -dine treatment in patients with HBeAg -negative chronic hepatitis B .J Hepatol ,2004,41∶1070～107613　Ryu SH ,Chung YH ,Choi MH ,et al .Long -term additional lamivu -dine therapy enhances durability of lamivudine -induced HBeAg loss :a prospective study .J Hepatol ,2003,39∶641～61914　Chien RN ,Yeh CT ,Tsai SL ,et al .Determinants for sustainedHBeAg response to lamivudine therapy .Hepatology ,2003,38∶1267～127315　党红星,何瑞,马跃东.拉米夫定致小儿锥体外系反应二例.中华儿科杂志,2004,42∶43616　Lok ASF ,Zoulim F ,Locarnini S ,et al .Monitoring drug resistancein chronic hepatitis B virus (HB V )-infected patients durin g lamivud ine therapy :evaluation of performance of INNO -LiPA HBV DR assay .J Clin Microbio ,2002,40∶3729～373417　Suzuki F ,Suzuki Y ,Tsubota A ,et al .Mutations of polymerase ,precore and core promoter gene in hepatitis B virus during 5-yearlamivudine therapy .J Hepatol ,2002,37∶824～83018　Qaq ish RB ,Pharm D ,Mattes KA ,et al .Ad fovir dipivoxil :A newantiviral agent for the treatment of hepatitis B virus infection .Clin Therapeut ,2003,25∶3084～309919　Bozdayi AM ,E yigun CP ,Turkyilmaz AR ,et al .A novel pattern(sW195a )in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S )mutation selected during lamivudine therapy and success -ful treatment with adefovir dipivoxil .J Clin Virol ,2004,31∶76～7720　Qarugan RB ,Gomez LC ,Serrano PL .Use of adefovir in the treat -ment of the chronic hepatitis B virus infection with res istance to lamivudine .Transplant Proc ,2003,35∶1841～184321　Villeneuve JP ,Durantel D ,Durantel S ,et al .Selection of a hepati -tis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation pa -tient .J Hepatol ,2003,39∶1085～108922　梁扩寰,主编.肝脏病学.第1版,北京:人民卫生出版社,1995.52023　张瑞琪,缪晓辉,倪武.膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例.中华传染病杂志,2002,20∶180～181(收稿:2004-12-10)(校对:郭顺明)肝癌动物模型的建立徐　静　综述　李　旭　审校作者单位:230022　合肥市　安徽医科大学附属医院感染科 自20世纪初获得小鼠自发性肝癌动物模型以来,人们对肝癌动物模型的研究不断深入,逐渐建立了诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型及转基因动物肝癌模型。

一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。

在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。

在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。

人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。

细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。

当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。

细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。

图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。

然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。

小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。

目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。

目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。

小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。

小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。

人肝癌多药耐药细胞系 Bel-7402／DOX 两种模型比较钟兴国;龚仁华;孙登群;曹葆强;范育林;姜世涛;蔡军;何新苗;骆会来【摘要】目的：比较体外浓度梯度递增诱导和裸鼠肝脏移植诱导两种方法建立人肝癌多药耐药细胞系Bel-7402/多柔比星（ Doxorubicin ，DOX）模型的生物学特性。

方法分别采用体外浓度梯度递增诱导和裸鼠肝脏移植诱导建立人肝癌多柔比星多药耐药细胞亚系Bel-7402/DOXV 和Bel-7402/DOXL 后，利用相差显微镜观察细胞，MTT法检测两种细胞的耐药性，细胞计数法绘制生长曲线并用公式法计算倍增时间，流式细胞仪测定细胞DOX的摄入和外排以及P糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、谷胱甘肽硫转酶系统（GSH/GST）的表达。

结果两组耐药细胞Bel-7402/DOXV 和Bel-7402/DOXL 对DOX、CD-DP均产生了交叉耐药性，较亲本Bel-7402 IC50值差异有统计学意义（P＜0．01）；较亲本细胞的倍增时间明显延长，分别为65 h和46 h；较亲本的DOX外排率明显升高，分别为81．06％、66．56％；两组耐药细胞P-gp、MRP表达较亲本细胞显著提高（ P＜0．01），而GSH/GST的表达无明显变化。

结论两种方法建立的耐药细胞系模型均有稳定的耐药性。

肝脏移植法更能高度模拟人肝癌，它是具有近似人肝癌生物学和抗癌药物动力学特征的较理想模型。

%Objective To compare the biological characteristics of two types of human hepatocellular carcinoma multi -drug re-sistant cell sub-lines Bel-7402/DOX models established by two methods .Methods We established human hepatocellular carcinoma doxorubicin multi-drug resistant cell sub-lines models Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL by in vitro concentration gradient in-creased induction and nude mice liver-implanted induction , respectively .Phase contrast microscopy was used to observe the cells and MTT ( methyl thiazolyltetrazolium ) method was used to detect drug resistance of the two different sub-lines of cells .The ingestion and excretion of cellular doxorubicin (DOX) and the expression of P-glycoprotein (P-gp), multi-drug resistance-sociated protein (MRP) and glutathione S-transfer enzyme system ( GSH/GST ) were detected by flow cytometry .Results The Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL generated cross-resistance to DOX and CDDP ( cis-Diaminedichloroplatinum ) , they showed a significant difference in re-sistance to Bel-7402 IC50 value (P<0.01).The doubling times were significantly extended , compared with the parent cell line (39 h) , and were 65 h ( Bel-7402/DOXV) and 46 h ( Bel-7402/DOXL) .The excretion rates of DOX were significantly increased , com-pared with the parent cell (34.14%) line and were 81.06%(Bel-7402/DOXV) and66.56%(Bel-7402/DOXL).Expressions of P-gp and MRP in the two groups of resistant sub-lines cells were significantly enhanced (P<0.01).There was no significant variation in the expression of GSH/GST (P>0.05).Conclusions Stable resistance is involved in the resistant cell line model established by the two methods above .Liver implantation is a good simulation of human hepatocellular and proves to be an ideal model with characteristics similar to human hepatocellular biology and the pharmacokinetics of anticancer drugs .【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】5页(P728-732)【关键词】肝癌;多药耐药;多柔比星;细胞系模型【作者】钟兴国;龚仁华;孙登群;曹葆强;范育林;姜世涛;蔡军;何新苗;骆会来【作者单位】230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科【正文语种】中文【中图分类】R735.7目前对于肝癌，尤其是对中晚期肝癌的治疗仍以手术及化疗相配合治疗为主。

常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。

本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。

一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。

（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。

普通培养基采纳DMEM，含10％的。

贴壁生长后，2～3天即可传代。

【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。

2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。

3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。

【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。

(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。

(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。

(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。

2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。

(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。

(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。

(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。

(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。