SMMC-7721人体肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察
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人肝癌SMMC-7721细胞培养体会①作者:王玥李应东来源:《中外医疗》2011年第02期【摘要】根据长期培养人肝癌SMMC-7721细胞的经验,总结出了一套培养细胞的方法,使得复苏细胞成活率大为提高,为进一步的实验研究奠定了基础。
【关键词】人肝癌SMMC-7721细胞细胞培养方法【中图分类号】 R73 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-0742(2011)01(b)-0026-01目前细胞培养技术已成为很重要的生物技术之一,它是医学、新药开发等实验研究的基础技术,其作用不容忽视。
人肝癌SMMC-7721细胞属于肝癌细胞系,现已广泛用于药物毒理、抗肿瘤等方面的研究,目前关与人肝癌SMMC-7721细胞的培养文献还比较少,我们对于人肝癌SMMC-7721细胞的培养条件和方法上进行了探索,现总结出一些经验。
1资料与方法1.1一般材料1.1.1实验细胞人肝癌SMMC-7721细胞株由甘肃兰州大学附属二院泌尿研究所惠赠。
1.1.2主要试剂D ulbcco’s Modified Eagle’Medium(DMEM)培养基:北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司磷酸盐缓冲液(PBS):氯化钠8.00g、十二水磷酸氢二钠2.885g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钾0.20、三蒸水配制,0.22μm滤膜过滤除菌,PH7.2~7.4,4℃保存。
新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃灭活30min。
胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(Trypsin 1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成浓度为0.25%溶液,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
青霉素、链霉素溶液:0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
1.1.3实验仪器二氧化碳培养箱:BB16UV德国Heraeus公司;超净工作台:VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司;倒置相差光学显微镜:IX71型,日本Olympus公司产品;恒温水浴锅:DZW-4型,金坛市恒丰仪器厂;纯净水系统:Milli-Q Biocel美国Millipore公司;电热恒温干燥箱:风热式,101型,北京科伟永鑫实验仪器设备厂;台式灭菌器:TMQ.J-2540型,山东新华医疗器械股份有限公司。
牛樟芝抗肝癌的效应与机制研究[背景与目的]全球每年新确诊的恶性肿瘤中约有9.2%为肝癌,在肝癌的新发病例中,亚洲约占70%,其中,我国的肝癌发病率居首位,且我国HCC患者的年死亡人数占全球HCC患者死亡人数的55%左右。
那些进展为HCC的患者几乎都在12个月内死亡,证明HCC进展极快且预后极差,因此,急需寻找有效的治疗药物。
ANCA-E-D是牛樟芝菌丝体的二氯甲烷提取物。
台湾当地居民一直用牛樟芝来治疗食物和药物中毒、腹泻、腹痛、皮肤瘙痒、改善免疫和肝功能等,而现代药理也证实,牛樟芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和神经保护等作用。
研究发现,牛樟芝与中药灵芝同属于多孔菌科的真菌,生长习性和性味相近,生物活性成分不同,尤其是牛樟芝的生物活性物质种类比单一种类的灵芝更多,且萜类和多醣等含量更高,故而近年来,牛樟芝的抗肿瘤和免疫调节等功效成为研究的热点。
我们认为牛樟芝具有扶正补虚和抗癌解毒的双重功效,是一种潜在的特异性的抗癌中药。
已有的研究证实,牛樟芝可以抑制肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的生长。
本研究中,我们利用SMMC-7721肝癌细胞株,通过体内和体外实验,利用基因芯片高通量的特点,初步探讨牛樟芝对肝癌细胞的体内外抑制作用和分子机制。
[方法]1.体内实验(1) SMMC-7721细胞(4×105 cell/只)接种至4~6周龄雄性BABL/c裸鼠右后肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型;(2)造模成功裸鼠随机分为3组(10只/组):生理盐水对照组,25 mg/kg ANCA-E-D实验组、50 mg/kg ANCA-E-D实验组,腹腔注射,每天1次,连续治疗21天;(3)观察裸鼠的一般状况,测量各组裸鼠的体重、移植瘤体积等;血液学检测血清ALT和AST含量;病理切片HE染色检测移植瘤和肝肾组织,IHC检测移植瘤组织的MVD和PCNA的表达,TUNEL检测移植瘤组织的细胞凋亡。
2.体外实验(1)0、20、40、60、80mg/LANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24、48、72h, MTT法检测SMMC-7721细胞的增殖抑制率;(2)0、20、40、60mg/LANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,Hoechst33258及瑞氏染色观察细胞形态;(3) 0、20、40、60、80 mg/L ANCA-E-D 处理SMMC-7721细胞24h,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡;(4)0、20、40、60 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,基因芯片检测差异基因的表达;[结果]体内实验:ANCA-E-D可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制裸鼠移植瘤中微血管的形成以及PCNA的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡;ANCA-E-D对移植瘤裸鼠的ALT和AST无影响。
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。