天津株(TJM-F92)高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后病毒血

５６　中国兽医杂志２０１７年（第５３卷）第７期　天津株（ＴＪ　Ｍ—Ｆ　９　２）高致病性猪繁殖与呼吸　综合征活疫苗免疫后病毒血症和抗体消长　规律的试验报告　

杨本勇，曹　东，顾贵波，赵晓彤，赵凤菊，于学武，关　淼，　李树博，王克才，李井春，魏澍　（辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳１１０１６４）　中图分类号：￥８５２．６５　９　文献标志码：Ｂ　文章编号：０５２９—６００５（２０１７）０７～００５６—０２　

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（ＨＰ—ＰＲＲＳ）是　由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急　性高致死性疫病。发病主要特征为怀孕母猪流产、　早产、木乃伊胎等，母猪流产率可达３０％以上；仔猪　出现严重的呼吸道症状，感染率可达１００％，死亡率　在５０％以上　ｊ。目前我国使用的高致病性猪繁　殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗，据报道活疫苗免　疫后可在动物体内复制并持续存在。为摸清高致　病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后在猪体内　的存在时问，我们进行了本试验，现报告如下。　

１材料与方法　１．１材料　１．１．１试验猪在某猪场选择２８～３０　Ｅｔ龄、未进　行高致病性猪繁殖与呼吸综合征免疫的长白仔猪　ｌ５头，经荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测，猪瘟、猪繁殖与呼吸　综合征、２型圆环病毒、猪伪狂犬病病毒均为阴性，　实验猪编号为Ａ１一Ａ１５。　１．Ｉ．２疫苗　天津株（ＴＪＭ—Ｆ９２株）高致病性猪　繁殖与呼吸综合征活疫苗，政府招标采购。　１．１．３　ＲＴ—ＰＣＲ试剂鉴别检测猪繁殖与呼吸综　合征（ＰＲＲＳ）高致病性强毒和致弱ＴＪＭ—Ｆ９２株疫　苗毒的ＲＴ—ＰＣＲ引物，由华威特生物科技有限公司　提供，扩增片段位于ＮＳＰ２基因；ｄＮＴＰ、Ｍ—ＭＬＶ反　转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂、Ｅｘ　Ｔａｑ聚合酶等，购自宝生　物工程（大连）有限公司。　１．１．４猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒购自　

收稿日期：２０１６一【１４—１３　基金项目：辽宁省重大动物疫病病原变异与综合防控技术研究　（２０１　１２１４００１）；高致病性猪蓝耳病综合防控与免疫净化技术推广　【辽财指农（２０１３）｛３３４号］　作者简介：杨本勇（１９７３一）．男，高级兽医师，本科，从事动物疫　病防控工作，Ｅ　ｍａｉｌ：ｂｅｎｙｏｎｇ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ　通讯作者：顾贵波，Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｕｇｕｉｂｏ８８８８＠１２６．ｔｏｎｉ　

北京天之泰生物科技有限公司，法国ＬＳＩ公司生产。　１．１．５　核酸提取试剂　核酸提取试剂盒（磁珠　法），购自西安天隆生物科技有限公司。　１．１．６试验器材ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量移液器，ＰＣＲ仪，　电泳仪，凝胶成像系统，西安天隆生物科技有限公　司ＮＰ９６８核酸提取仪，伯乐ｉＭａｒｋ酶标仪。　１．２方法　１．２．１免疫注射按疫苗说明书提供的免疫剂量　和注射部位对试验猪进行免疫注射。　１．２．２采血试验猪在免疫前采血１次；免疫后每　隔１周采血１次，连续采ｌ０周；以后每隔２周采血１　次，连续采４次。无菌分离血清，进行高致病性猪繁　殖与呼吸综合征疫苗毒（ＴＪＭ—Ｆ９２株）核酸检测和　抗体检测。　１．２．３　高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（ＴＪＭ—　Ｆ９２株）核酸检测用ＲＴ—ＰＣＲ方法进行检测。　１．２．３．１核酸提取在９６孔核酸提取板的第１列　孔及第７列孔中分别加入２００　Ｌ血清，１０　ＩｘＬ　Ｐｒｏ—　ｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ，４　ｔｘＬ　Ａｃｒｙｌ　Ｃａｒｒｉｅｒ，然后将板放入核酸提　取仪中，按说明书程序进行自动化提取。　１．２．３．２反转录　样品ＲＮＡ　５　Ｌ，反转录引物　１　Ｌ，１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　２　ｔｘＬ，５×Ｂｕｆｆｅｒ　４　ｔｘＬ，Ｍ—　ＭＬＶ　１　Ｌ，ＲＮＡ酶抑　４齐０　１　ｔｘＬ，ＤＥＰＣ水５　Ｌ。混　匀，４２℃水浴１小时，７０℃水浴１５分钟后冰上冷　却，得到ｃＤＮＡ溶液用于ＰＣＲ扩增。　１．２．３．３　ＰＣＲ扩增　ｃＤＮＡ　２　Ｌ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２　Ｌ，　２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　１．５　Ｌ，上、下游引物各０．５　Ｌ，　Ｅｘ　Ｔａｑ聚合酶０．５　，双蒸水１３　。混匀后将薄壁　ＰＣＲ管放入ＰＣＲ仪中，按如下程序扩增：首先９５℃　预变性５　ｍｉｎ；然后９４　ｃ【＝３０　Ｓ，５６　ｏＣ　６０　Ｓ，７２　ｏＣ　４５　Ｓ，　３５个循环。最后７２℃延伸１０　ｍｉｎ。反应结束后，将　ＰＣＲ产物用浓度为１．５％琼脂糖凝胶电泳，电压　１００　Ｖ，电泳２０　ｍｉｎ。电泳结束后用凝胶成像系统观察。　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１７年（第５３卷）第７期　５７　若扩增出约６４４　ｂｐ的特异性条带，则高致病性猪繁殖　与呼吸综合征活疫苗毒（ＴＪＭ—Ｆ９２株）核酸阳性。　１．２．４猪繁殖与呼吸综合征抗体检测　按试剂盒　说明书的步骤和要求操作。阻断率（ＩＲＰＣ）大于　２０％为抗体阳性，阻断率越大，抗体水平越高。　２结果与分析　２．１　ＴＪＭ一１７９２株疫苗核酸检测结果（表１）由表１　可知，免疫前疫苗毒核酸均为阴性。在免疫后１周　时有４头猪疫苗毒核酸为阳性，阳性率２７％（４／　１５），免疫后２周时阳性率１３％（２／１５），在免疫后　第３周时阳性率最高，为４７％（７／１５），此后开始下　降，至第６周时只有７％（１／１５）。从第７周开始再　没有检出阳性，表明，ＴＪＭ—Ｆ９２株高致病性猪繁　殖与呼吸综合征疫苗毒的病毒血症时问最长为　６周　

表１　血清中ＴｌＪＭ—Ｆ９２株疫苗毒核酸检测结果　畜号　阳性数　免疫前　免后１周　免后２周　免后３周　免后４周　免后５周　免后６周　免后７周　免后８周　免后９周　免后１０周　免后１２周　免后１４周　免后ｌ６周　

２．２猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果见表２。　从表２可以看出，由于母源抗体的存在，免疫前抗体　阳性率达到８７％，免疫后抗体阳性率开始下降，至　免疫后第２周时下降至３３％，随后开始缓慢上升，　至免疫后第３周时上至４７％，第４周时升至５３％，　到免疫后第５周时突然上升至１００％，并一致持续　到第１２周，随后开始稍有下降。抗体平均阻断率在　免疫前也处在较高水平，达到７２％，免疫后开始下　降，至免疫后第２周时降至最低，只有１８％，为阴　性。此后开始慢慢上升，至免疫后第６周时达到最　高值７８％，此后开始缓慢下降。　

３讨论　３．１从实验猪血清中　Ｍ一１９２株高致病性猪繁殖　与呼吸综合征疫苗毒存在时间的变化规律可以看出，　不同猪只病毒血症的持续时间差异较大，有的没有出　现病毒血症，有的只存在１周，最长的可以达到免疫　后第６周。因此ＴＪＭ一１９２株高致病性猪繁殖与呼吸　综合征疫苗免疫后病毒血症持续时间为６周。　３．２本试验的抗体检测结果表明，疫苗免疫后，猪　体内的母源抗体会明显下降，降到合格临界值附近，　

表２猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果　检测时间检　量　量　平　断率　，　，　，％　，％　

这一低水平的抗体一直持续至免疫后第４周，从第　５周开始疫苗免疫产生的抗体水平明显上升，至第６　周时达到最高水平，并维持在一个平台到免疫后第　１６周，本试验的结果表明，无论仔猪的母源抗体水　平高低，免疫后大约都需要经过４周左右的时间才　

Ｏ　４　２　７　３　０　ｌ　Ｏ　０　０　Ｏ　０　Ｏ　０　一　一　＋　＋　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　十　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　＋　～　～　一　～　～　～　～　～　～　～　一　一　一　一　＋　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　十　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　十　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　＋　一　一　一　一　一　一　一　一　一　一　５８　Ｉ。１４，ｉｋ杂志２（１１７年（第５３　）　７期　甘肃武威凉州区绵羊主要疫病的血清学调查　蔡峰山。，许奎　（１．Ｉ『肃省武威市凉州Ｉ区羊下坝镇斋牧　站，ｌ『肃武威７３３０（０）；２．Ｉ　ｒ肃省武威市凉州ＩＸ斋牧ｍｉ　ｆ　￣＇－，．１　１６，Ｉｒ卅武贼７３３０００）　中图分类号：Ｓ８２６．９　文献标志码：Ｂ　文章编号：０５２９　６００５（２０１　７）０７—００５８—０２　

近年来，在石羊河流域治理项日的扶持下，在　符级政府和业务部门的大力史持下，凉州区养羊业　得到了迅猛发展一截至２０１５年底，　区羊仃栏达到　２４０　只，建成养殖暖棚３０万　．建成规模养殖场　（小　）ｌ　１６３个，规模养殖户达４．６万，　ｆｌＪ随着　绵　饲养规模的扩大、从山东等地引种混养以及养　殖　防疫意识不强等原凶，在个　各乡镇养　场　同秤度地发生Ｊ，一些疫病，给倒养场（，ｒＬ１）造成Ｊ，重　人经济损失，严重威胁养羊、　健康发腱　凉州　动物疫病预防控制ｒ｝１心于２０ｌ５年９　Ｊｊ　ｌ５—２０　ｉｔ组织有关专家在凉州Ｉ　下坝镇斋牧　ｔｌ￣ｇ：ｉ｝ｌ期：２０１６一（）８—３（）　ｆ１　１１ｊｆ简介：禁峰【ＩＩ（１９８５一）　男，曾　帅．水科　９Ｉ对Ｉ　．ｆ１　，Ｅ－ｎｍｉｌ：＇￣，ｗ６９６ｌ０８４＠１２６．ｔ　ｔｌＩ１１　医站技术人员、村级动物防疫员＿羽１部分养羊场业主　及驻场兽医的协助卜外腱ｒ绵羊主要疫病血清学　凋查一本次血清学调奄先后选取ｌ０个免疫羊群和　５个非免疫羊群，每个羊群随机抽取５０份【０【样，共　采集血清样本７５０份，采用酶联免疫吸附试验　（Ｅ１　ＩＳＡ）、问接血凝试验（ＩＨＡ）等【血清学榆测方法　对绵羊主要疫病Ｊ０【消ｔ－：抗体进行检测，从　了解和掌　握凉州　主要羊痫免疫抗体水　或隐性感染情况，　为卜・步　展绵　要疫痫防控提供科　：依据　

１材料与方法　１．１　试剂准备　小反如１兽疫抗体榆测试剂盒，购　自深圳真瑞生物科技　限公ｒ　；　鲁菌病平板凝　打动物疫　集试验检测试剂，购广１　Ｉ　岛易邦　物　Ｉ：一１有限公　；　传染性胸膜肺炎…Ａ愉测试剂，购自兰州斋　

能产牛较高的抗体水平？因此免疫后的第ｌ怙Ｊ至第　４周抗体水平比较低，是比较危险的时期。　．　３．３　比较实验猪的病毒血症　牢与平均抗体水　平的变化规律（见图１）可以发现，病毒ｍ症的严重　程度与抗体水平的高低呈负卡｝】父，即抗体水平低　时，病毒血症就比较严重，随着抗体水平的不断上　１００１》‘　８ｏ％　６０　２０％　０％　升，病毒血症逐渐减弱，　抗体维持在较高水平时，　病毒血症消失　这种现象的　现，可能足动物体　内疫苗毒同抗体之问“Ⅱ卡Ｈ　卜争”的结果，疫前免疫　后刺激动物机体产　卜抗体，产生的抗体义小断的将活　疫苗毒巾和。而随着免疫时　的延长，抗体水平进一　步提高，疫苗毒不断的被巾和，以致尤法被检测剑　．