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第三十章疱疹病毒一、名词解释1．潜伏感染2．整合感染3．巨细胞病毒4．人类疱疹病毒6型5．EV 6．异嗜性抗体7．VCA—IgA抗体8．永生化二、填空题1．常见的人类疱疹病毒包括──、──、──、──等。
2．疱疹病毒中最常引起胎儿先天性感染的是──病毒；与鼻咽癌有关的病毒──病毒。
3．可潜伏在三叉神经节的病毒是──，潜伏在骶神经节的病毒是──。
4．通过垂直传播引起胎儿畸形的疱疹病毒是──和──。
5．病毒感染细胞后可表现为──感染、──感染、──和──感染。
6．疱疹病毒的核酸类型是──，衣壳呈──，──包膜。
7．与宫颈癌关系密切的病毒有──、──和──。
8．HSV的传播途径主要有──、──和──。
9．HSV的原发感染类型主要是──感染，VZV的原发感染类型主要是──感染。
10．带状疱疹只发生于幼年得过──的成人，发病的主要原因──下降。
11．巨细胞病毒除通过垂直传播外，还可以通过──、──和──途径传播。
12．EBV的传播主要是通过──方式，也可以通过──途径感染。
13．HHV一6型的原发感染引起──，还可与──共同感染CD4+细胞。
14．EB病毒与──癌关系密切。
若孕妇血清中检出巨细胞病毒IgM类抗体，提示胎儿有──。
15．HSV—I潜伏于──和──神经节中，HSV一Ⅱ潜伏于──中。
HSV一Ⅱ感染与癌的发生有密切关系。
16．儿童期初次感染水痘一带状疱疹病毒，表现为──；成人复发者表现为──。
17．与EB病毒感染有关的疾病主要有──、──、──。
18．CMV的感染途径有──、──、──、──、──。
19．可感染免疫抑制状态下B细胞的病毒为──。
三、最佳选择题1．可导致胎儿先天性畸形的一组病毒是( )A．柯萨奇病毒、流感病毒、腮腺炎病毒B．风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒C．HIV、乙型脑炎病毒、丙型肝炎病毒D．巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒E．EB病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒2．疱疹病毒不包括( )A．HSV B．VZV C．CMV D．HBV E．EBV3．不符合单纯疱疹病毒特点的一项是( )A．患者和健康者为传染源B．主要经飞沫传染C．原发感染后可形成潜伏感染D．婴幼儿感染HSV—I绝大部分无临床表现E．HSV一Ⅱ与宫颈癌有密切关系4．对疱疹病毒的错误叙述是( )A．均为双股DNA有包膜病毒B．主要通过接触传播C．免疫力低下者在原发感染后形成潜伏感染D．婴幼儿感染多为隐性感染E．病毒基因与宿主基因的整合与致癌关系密切5．下列病毒中可引起潜伏感染的是( )A．麻疹病毒B．疱疹病毒C．风疹病毒D．乙型脑炎病毒E．乙型肝炎病毒6．HSV—I在体内的潜伏部位是( )A．疱疹复发部位神经末梢B．疱疹复发部位淋巴结C．口腔粘膜毛细血管内皮细胞D．三叉神经节E．骶神经节7．带状疱疹的病原是( )A．HSV—I B．HHV一6 C．CMV D．HSV一ⅡE．VZV8．与鼻咽癌有关的病毒是( )A．鼻病毒B．EB病毒C．人类嗜T细胞病毒D．人乳头瘤病毒E．巨细胞病毒9．疱疹病毒潜伏感染的特性是( )A．大多由显性感染转变而来B．大多由dsRNA病毒引起C．体内始终能检出病毒颗粒D．病毒基因通过逆转录方式与宿主基因整合E．妊娠可激活潜伏感染并危及胎儿10．核酸类型为RNA的病毒是( )A．EB病毒B．巨细胞病毒C．单纯疱疹病毒D．风疹病毒E．腺病毒11．传染性单核细胞增多症的病原是( )A．EB病毒B．巨细胞病毒C．单纯疱疹病毒一2型D．单纯疱疹病毒-l型E．水痘带状疱疹病毒12．巨细胞病毒引起的疾病不包括( )A．肝炎B．先天性畸形C．间质性肺炎D．输血后单核细胞增多症E．口唇疱疹13．通过输血传播的疱疹病毒有( )A．EBV、VZV B．HSV、EBV C．CMV、EBV D．VZV、HSV E．HSV、CMV14．通过性接触传播的疱疹病毒有( )A．EBV、HSV B．CMV、EBV C．VZV、HSV D．HSV、CMV E．VZV、EBV15．HSV—I的原发感染多引起( )A．成人生殖器疱疹B．儿童口唇疱疹C．6个月以上婴幼儿隐性感染D．传染性单核细胞增多症E．疱疹性脑炎16．HSV一Ⅱ的潜伏部位是( )A．三叉神经节B．迷走神经节C．颈上神经节D．骶神经节E．B淋巴细胞17．正B病毒的潜伏部位是( )A．T淋巴细胞B．B淋巴细胞C．嗜中性粒细胞D．骶神经节E．三叉神经节18．下列哪项不是巨细胞病毒感染的快速诊断方法( )A．细胞培养分离病毒B．尿沉渣细胞镜检观察巨细胞及核内嗜酸性包涵体C．PCR技术检测标本中的CMV基因D．荧光抗体检测标本中的CMV抗原E．ELISA检测患者体内CMV特异性IeM19．最常引起胎儿先天性畸形的病毒是( )A．HIV B．HBV C．CMV D．HSV—I E．HSV一Ⅱ20．下列哪项不是可以在人二培体细胞中培养的疱疹病毒( )A．HSV—I B．HSV一ⅡC．CMV D．EBV E．VZV21．疱疹病毒增殖性感染的激活原因主要有( )A．妊娠B．其它微生物感染C．情绪紧张D．应用免疫抑制剂E．病毒变异22．下列哪项不是疱疹病毒引起的感染类型( )A．迟发感染B．隐性感染C．整合感染D．潜伏感染E．先天感染23．巨细胞病毒的潜伏部位不包括( )A．乳腺B．肾脏C．涎腺D．白细胞E．红细胞24．不引起小儿皮疹的病毒为( )A．风疹病毒B．麻疹病毒C．HHV一6 D．HHV一7 E．HHV一825．无EB病毒受体的细胞为( )A．B细胞B．T细胞C．腮腺管上皮细胞D．咽部上皮细胞E．宫颈外上皮细胞26．对于应用无环鸟苷治疗有效的病毒为( )A．HSV B．HBV C．EBV D．HFRSV E．CMV27．体外培养能形成巨大细胞和猫头鹰眼状嗜酸包涵体的是( )A．CMV B．HSV C．VZV D．EBV E．HBV28．与卡波济肉瘤有关的病毒为：( )A．EBV B．HHV6 C．HHV8 D．HHV7 E．HSV四、问答题1．简述疱疹病毒的生物学特性和致病特点。
常用抗凝剂的配制及用法专业相关2010-08-08 14:48:34 阅读458 评论0 字号：大中小订阅在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。
对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。
一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时,常用它作动物全身抗凝剂，肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。
注意事项：做全血DNA提取的时候抗凝剂不能采用肝素！因为肝素是聚合酶链式反应的抑制剂！（2）配制和用量纯的肝素10mg能抗凝65~125 ml血液(按lmg等于125U，10~20U能抗1 ml血液计)。
但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，因而其抗凝效果也不相同。
一般可配成1％肝素生理盐溶液，用时取0．1毫升于试管内，100℃烘干，每管能抗凝5～10ml血液。
也可将抽血注射器用配好肝素湿润一下管壁，直接抽血至注射器内而使血液不凝。
在动物实验作全身抗凝时，一般剂量为：大白鼠2．5～3．0mg/200～300g体质量，兔10mg／kg体质量，狗5～10mg／kg体质量。
肝素可改变蛋白质等电点，因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时，不可采用肝素。
市售的肝素钠溶液每毫升含肝素12500U，相当于100mg。
二、草酸盐合剂（1）原理草酸胺能使血细胞略为膨大，而草酸钾能使血细胞微缩小，因此草酸铵与草酸钾按3：2比例配置，可使血细胞体积保持不变；加福尔马林则能防止微生物在血中繁殖。
此抗凝剂最适于作红细胞比积测定。
（2）配制方法及用量草酸铵1．2g、草酸钾0．8g、福尔马林1．0ml、蒸馏水加至100ml每毫升血加草酸盐合剂0．1ml(即相当草酸铵1．2mg，草酸钾0．8mg)。
根据取血量将计算好的草酸盐剂量加入玻璃容器内烤干备用。
如取0．5ml于试管，烘干后每管可使5ml血不凝固。
EBNA2 基因在淋巴母细胞中的表达发表时间：2020-04-07T16:39:56.303Z 来源：《医师在线》2020年3期作者：路素丽[导读] 通过检测EBNA2在EBV转化的淋巴母细胞的表达分析，[摘要] 目的：通过检测EBNA2在EBV转化的淋巴母细胞的表达分析，为研究EBV相关淋巴瘤的发生发展提供相应科研数据。
方法：采用免疫组织化学法检测EBNA2基因在EBV转化淋巴母细胞的细胞蜡块和正常人淋巴细胞的细胞蜡块中的阳性结果。
结果：EBNA-2在转化淋巴母细胞的细胞蜡块中呈现棕褐色颗粒的阳性表达，而在正常淋巴细胞细胞蜡块中不表达。
结论：EBNA2在EBV转化的永生化淋巴细胞的细胞蜡块中表达，我们推断EBNA2在EB病毒相关恶性淋巴瘤的形成过程中可能起了某些促进作用。
关键词：EB病毒（EBV）；EB病毒核抗原-2（EBNA2）；淋巴瘤EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是一种嗜人类淋巴细胞的双链γ-DNA疱疹病毒[1]，研究发现大部分的成年人均感染过EB病毒，多表现为B淋巴细胞终身携带无症状感染。
EB病毒潜伏感染状态通常表达为三个潜伏膜蛋白和六个核蛋白[2]，其中EBNA-2是EB病毒在感染宿主细胞后最早表达的病毒基因产物之一，本实验在体外培养建立EBV转化的淋巴细胞，采用免疫组织化学技术检测EBNA2在EB病毒转化淋巴母细胞的细胞蜡块和正常淋巴细胞以中的阳性表达情况，来推测和研究分析EBNA2在EB病毒相关淋巴瘤中的作用以及影响。
1.材料与方法1. 1 获取转化淋巴细胞采取饥饿法将B95-8细胞放置7天至9天，然后收集培养液，1000转/分钟速度离心后弃掉上清，从而得到EB病毒的悬浮液。
再进行分离全血淋巴细胞，取EB病毒重悬淋巴细胞，在培养箱培育。
获得细胞聚集成团生长的EB病毒转化淋巴母细胞，镜下观察转化的淋巴母细胞体积比正常淋巴细胞体积明显增大[2]。
1. 2 免疫组织化学技术检测EBNA2的阳性表达情况收集大量培养的细胞，转移至离心管，以2000/分钟的离心速度离心5-6分钟，并且重复离心三次。
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS12031.2 v.A GENMED陈旧血红细胞溶解液产品说明书（中文版）主要用途GENMED陈旧血红细胞溶解液是一种旨在通过化学方法来溶解采集在EDTA处理的存放时间超过72小时以上的全血样品中的血红细胞，然后离心去除以获得纯化白细胞的权威而经典的技术方法。
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其中陈旧全血常常出现不完全性溶血现象，造成分离的困难。
产品内容GENMED溶解液(Reagent A) 500毫升产品说明书 1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证12个月用户自备PBS(GMS12033)或HBSS溶液(GMS12028)：用于细胞清洗白细胞完全培养液(GMS12052.2)：用于分离白细胞的培养白细胞冻存液（GMS10001.2）：用于白细胞的长期保存15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器台式离心机：用于沉淀细胞实验步骤实验开始前，4℃预冷用户自备的PBS溶液。
然后进行下列操作。
1．准备1个无菌的15毫升锥形离心管2．轻轻混匀新鲜的EDTA抗凝的全血样品3．移出2毫升全血样品到15毫升锥形离心管4．加入 毫升4℃预冷的GENMED溶解液(Reagent A)5．轻轻上下倾倒离心管5次，确保充分混匀6．室温下孵育10分钟，期间轻轻上下倾倒离心管数次（注意：肉眼可能观察到血液颜色由不透明红色到清澈红色的变化）7．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g8．小心抽掉上清液，留下500微升液体，以防抽掉白细胞颗粒群9．用手指轻弹离心管2至3下，使白细胞颗粒群松动10．即刻加入5毫升4℃预冷的用户自备的PBS或HBSS溶液11．用移液管轻轻抽吸5－10次，使白细胞颗粒群松散和充分混匀12．放进台式离心机离心10分钟，速度为300g13．小心抽掉上清液14．用手指轻弹离心管2至3下，使白细胞颗粒群松动15．（选择步骤）如果需要清除残余血红细胞，重复实验步骤4至1416．加入5毫升用户自备的白细胞完全培养液，进行细胞培养17．（选择步骤）或加入1毫升用户自备的白细胞冻存液，放进－80℃冻存18．（选择步骤）或即刻加入5毫升4℃预冷的用户自备的PBS溶液，进行后续实验（包括白细胞分离、鉴定、染色、标记、DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等）注意事项1．本产品为500毫升规格。
《微生物学》期末复习简答题及答案1.简述免疫球蛋白的基本结构。
答：①四肽链结构：重链、轻链②免疫球蛋白的分区：可变去和恒定区高变区和骨架区、铰链区③免疫球蛋白的其他结构：连接片（J链）、分泌片（SP）.2.抗体的生物功能主要有哪些？答：①特异性的生物学作用、②激活补体、③与细胞表面FC受体结合：调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，介导I型超敏反应④穿过胎盘和粘膜。
3.比较五类免疫球蛋白结构和功能的异同点。
答：共分为五类：①IgG、②IgM。
③IgA、④IgD、⑤IgE：①IgG血清含量最高，半衰期最长；功能最多：结合抗原、激活补体、调理吞噬并介导ADCC、通过胎盘、结合SPA.为再次免疫应答的主要抗体：抗感染的主要抗体（抗菌、抗病毒。
抗毒素抗体）。
并介导II、III型超敏反应。
2、IgM分子量最大，不能通过血管壁，主要存在于血液和粘膜表面。
是血管内抗感染的主要抗体。
在个体发育过程和体液免疫应答中均是最早合成和分泌的抗体。
脐带血IgM增高提示胎儿有宫内感染；感染过程中血清IgM 水平升高，说明有近期感染。
天然的血型抗体和类风湿因子亦属IgM.其激活补体的能力比IgG强。
膜表面IgM 是B细胞抗原受体（BCR）的主要成分。
只表达mIgM是未成熟B细胞的标志，记忆B细胞表面的mIgM逐渐消失。
3、IgA（1）血清型IgA：以单体形式存在。
（2）分泌型IgA（sIgA）：由J链连接的二聚体和分泌片组成。
合成和分泌的部位在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。
是参与粘膜局部免疫的主要抗体。
婴儿可从母亲初乳中获得分泌型IgA，是一种重要的自然被动免疫。
4、IgD正常人血清IgD浓度很低，平均约0.03mg/ml.半寿期很短（仅3天）。
血清IgD的确切功能仍不清楚。
B细胞表面的mIgD可作为B细胞分化发育成熟的标志，未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞可同时表达mIgM和mIg。
EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能【关键词】EBNA2Construction of eukaryotic expression vector of EBNA2 and functional detection of its product【Abstract】AIM: To construct the eukaryotic expression vector of EBNA2 and to express it in eukaryotic cells and detect the function of its product. METHODS: EBNA2 gene was obtained by PCR and DNA recombination from the plasmid pSG5EBNA2. PCR product of EBNA2b was then inserted into plasmid pMD18T and sequenced. The full length EBNA2 gene was cut and inserted into eukaryotic expression plasmid pCMVHA. Using LipofectamineTM 2000, the plasmid pCMVEBNA2 was transfected into Cos7 and then detected by Western blot and immunofluorescence. The activity of EBNA2 was detected by luciferase reporter assay. RESULTS: The EBNA2 gene was successfully cloned and its sequence was identical to that in GenBank. After plasmid pCMVEBNA2 was transfected into Cos7, the expressed product of EBNA2 was detected by Western blot and immunofluorescence. The transcriptional activity of EBNA2 was demonstrated by reporter assay. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pCMVEBNA2 has been successfullyconstructed and successfully expressed in eukaryotic cell line. The EBNA2 protein has transcriptional activation.【Keywords】EBNA2; clone; expression; genetic vector【摘要】目的：构建EB病毒核心抗原2（EBNA2）的真核表达载体，在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能. 方法：应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因，插入到真核表达载体pCMVHA中. 应用脂质体的方法将重组质粒pCMVEBNA2瞬时转染Cos7细胞，通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达. 应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性. 结果：克隆EBNA2的编码基因，经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致. 以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos7细胞，EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实. 荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性. 结论：成功构建EBNA2的真核表达载体，证实其在真核细胞Cos7可以表达，并具有转录激活功能.【关键词】EBNA2基因；克隆；表达；遗传载体0引言EB病毒核心抗原2（EBNA2）的编码产物是EB病毒体外感染细胞时最先表达的蛋白，作为一种转录因子，它可以调节病毒及细胞内多种基因表达，如LMP1，LMP2A［1］，CD21，CD23及cmyc等，同时还可以抑制细胞免疫球蛋白重链的转录. Notch信号途径是体内一个非常保守的信号途径，在体内分布十分广泛［2］. EBNA2可以与Notch信号途径中的重要分子RBPJκ相结合，激活下游靶基因，并通过模仿Notch信号途径对体内淋巴细胞的分化和发育方向起调控作用［3］. 同时EBNA2还可以促进抑癌分子p53的磷酸化［4］，调节癌基因的表达. 我们对EBNA2基因进行了克隆，并在真核细胞中表达，为进一步探讨其对小鼠免疫系统发育过程的影响奠定基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌XL10；质粒载体pCMVHA，pBluscript（-），pGA9816为本室保存. 载体pMD18T购自TaKaRa公司. Cos7细胞为本室保存. 脂质体LipofectamineTM 2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司. 抗EBNA2抗体购自Dako公司，HRP标记抗小鼠IgG, FITC标记抗小鼠IgG购自博士德公司. 小量质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒均购自华瞬生物工程公司. PCR试剂盒、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司. 根据GenBank中EBNA2基因的序列，设计2条引物：引物2的5′端加入XhoⅠ位点，引物1和引物2用于扩增EBNA2基因的3′端部分（EBNA2b）. 引物1：5′CTCGGGGCCACCATGGTGGC3′；引物2:5′CGCCTCGAGTTACTGGATGGAGGGG3′.1.2方法1.2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建EcoRⅠ/BglⅡ/SalⅠ三酶切质粒pSG5EBNA2，胶回收4.0 kb大小片段，将回收片段插入经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切开的pBluscript（-）载体中，命名为pBSSKEBNA2. 以pSG5EBNA2为模板，用引物1和引物2进行常规PCR反应，扩增EBNA2基因的3′部分EBNA2b. PCR反应条件：于94℃变性5 min后，按下列参数循环35次：即94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后于72℃延伸7 min. PCR产物克隆到pMD18T 载体中，NcoⅠ/XhoⅠ酶切鉴定阳性克隆，命名为pMDEBNA2b. 用NcoⅠ/XhoⅠ从pMDEBNA2b中切下EBNA2b片段插入用NcoⅠ/Xho Ⅰ切开的pBSSKEBNA2载体pBSSKEBNA2a中，NcoⅠ单酶切和EcoR Ⅰ/XhoⅠ双酶切鉴定，命名为pBSSKEBNA2（a+b）. pCMVEBNA2用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切质粒pBSSKEBNA2（a+b），回收1500 bp片段，将其插入EcoRⅠ/XhoⅠ切开的pCMVHA载体中，酶切鉴定阳性克隆，命名为pCMVEBNA2.1.2.2EBNA2表达的检测①Western blotCos7细胞于转染前1 d接种于直径60 mm中皿，接种4×105个细胞, 接种16 h后，应用LipofectamineTM 2000 10 μL转染质粒pCMVEBNA2 4 μg. 转染60 h后裂解细胞收集蛋白上清，加入2×加样缓冲液，煮沸5 min. 然后进行120 g/L SDSPAGE电泳，于180 mA稳压状态下转膜3 h. 于室温用20 g/L蛋白干粉封闭1 h后，一抗antiEBNA2（1∶1000）4℃过夜. PBST 洗涤3次，每次5 min. 二抗抗鼠IgGHRP （1∶4000）室温作用1 h，同上洗涤后，进行放射性显影. ②免疫荧光Cos7细胞于转染前1 d接种于直径60 mm中皿，于皿底事先加入圆形玻片，转染过程同上，对照组转染质粒pCMVHA. 转染60 h后取出爬有细胞的玻片，PBS洗涤3次，每次5 min；10 g/L BSA 37℃封闭1 h；一抗antiEBNA2 （1∶200）37℃避光湿盒中染色1 h；同上洗涤；二抗抗鼠IgGFITC （1∶500）37℃避光湿盒中染色1 h；同上洗涤后，荧光显微镜观察.1.2.3共转染报告质粒检测荧光素酶强度细胞准备和转染过程同上，对照组转染：pGA9816 0.2 μg，βgal 0.2 μg，pCMVHA 1.6 μg；检测组转染：pGA9816 0.2 μg，βgal 0.2 μg，pCMVEBNA2 0.2 μg，pCMVHA 1.4 μg. 转染48 h后收细胞. 反复液氮中冻溶裂解，充分震荡混匀，样品与反应底物1∶5比例混合后，照度仪中检测荧光素酶强度. 2结果2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建以质粒pSG5EBNA2为模板,PCR扩增EBNA2基因的3′端部分称为EBNA2b(494 bp),回收后插入载体pMD18T中,获得重组质粒pMDEBNA2b,经过测序,结果证实与GenBank中的相对应部分序列完全一致. 应用限制性内切酶将EBNA2基因的5′端部分EBNA2a插入载体pBluescript(-), 获得重组质粒pBSSKEBNA2a,经过拼接最终获得重组质粒pBSSKEBNA2,酶切鉴定,结果完全符合实验设计. 重组质粒pBSSKEBNA2和质粒pCMVHA分别用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后，进行连接转化，获得重组质粒pCMVEBNA2（图1），经酶切鉴定（图2）正确（EcoRⅠ/XhoⅠ1470；NcoⅠ928）.图1重组质粒pCMVEBNA2图2重组质粒pCMVEBNA2的酶切鉴定2.2EBNA2的检测质粒pCMVEBNA2应用脂质体转染Cos7细胞，转染60 h后，收取蛋白上清，Western blot检测EBNA2蛋白的表达，可在Mr 85 000处见一条特异性条带（图3），条带大小符合预期. 质粒pCMVEBNA2和pCMVHA应用脂质体转染Cos7细胞爬片，转染60 h 后，取出爬片，免疫荧光检测EBNA2蛋白的表达. 在荧光显微镜下放大20倍时,对照组仅有微弱的非特异荧光，转染组则可见较强荧光(图4).图3Western blot检测EBNA2的表达图4免疫荧光检测EBNA2的表达×202.3EBNA2荧光素酶检测质粒pCMVEBNA2和报告质粒pGA9816用脂质体lipofectamineTM 2000共转染Cos7细胞，转染48 h 后，反复冻融裂解，收取蛋白上清，与作用底物1∶5混合后，于照度仪上检测荧光素酶强度，结果可见共转组与对照组结果存在显著性差异，共转染组是对照组的50倍左右.3讨论1964年，英国生物学家Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤中分离得到一种γ疱疹病毒［5］，命名为EB病毒，EBNA2是EB病毒所表达的9种功能性蛋白之一. 在EB病毒感染B淋巴细胞过程中，EBNA2作为关键性的转录因子，通过激活细胞和细菌内的多种靶基因，可以使B淋巴细胞形成永生化. RBPJκ在与notch信号途径胞内段（NotchIC）结合后可以激活下游基因，调节体内的多种生理功能，如造血干细胞的分化，神经元的形成，T/B细胞的发育等［6］. 近年来的研究表明，EBNA2是NotchIC 的一种功能性同源蛋白，它的保守区5和保守区6可以结合于RBPJκ的相应区域［7］，起到类似NotchIC的作用，模仿Notch途径激活下游靶基因. 我们成功地从质粒pSG5EBNA2中再克隆得到了EBNA2基因的全长序列，并插入到真核表达载体pCMVHA，在真核细胞中得到表达. 经过对质粒pSG5EBNA2的5′端编码序列测序，我们发现在EBNA2开放读框起始密码子ATG之前存在一个EcoRⅠ位点，所以我们以EBNA2读框中段的NcoⅠ酶切位点为分界点，将EBNA2分为a和b两部分，5′端编码序列采用酶切获得，3′端编码序列采用PCR获得，然后再将其拼接成完整读框方法最终得到EBNA2基因的完整序列. EBNA2基因插入HA标签的下游，中间间隔EcoR I位点，所以HA和EBNA2基因分别独立表达.在检测EBNA2蛋白表达的实验中，我们可以看到Western blot的结果条带出现在Mr 85×103左右的位置，这与EBNA2蛋白Mr 53×103存在较大出入. 这主要是由于在EBNA2蛋白中含有28%的脯氨酸，使其分子的二级空间结构变大，EBNA2蛋白在凝胶中迁移速度变慢所造成的. 在检测荧光素酶激活强度的实验中，共转染组约是对照组的50倍左右，充分说明EBNA2蛋白具有转录激活活性. 综上所述，我们克隆得到了EBNA2的全长基因，并证实其在真核表达系统中能够表达，为以后将其克隆入其他表达载体，进行进一步的功能研究提供方便，为进一步探讨EBNA2对免疫系统发育的影响奠定了基础.【参考文献】［1］Sung NS, Kenney S, Gutsch D, et al. EBNA2 transactivates a lymphoidspecific enhancer in the BamHI C promoter of EpsteinBarr virus ［J］. J Virol, 1991,65:2164-2169.［2］ArtavanisTsakonas S, Matsuno K, Fortini ME. Notch signalling ［J］.Science, 1995,268:225-232.［3］Sakai T, Taniguchi Y, Tamura K, et al. Functional replacement of the intracellular region of the notch1 receptor by EpsteinBarr virus nuclear antigen 2［J］. J Virol, 1998, 6034-6039.［4］Lin CS, Kuo HH, Wang WB，et al. EpsteinBarr virus nuclearantigen 2 retards cell growth, induces p21WAF1 expression, and modulates p53 activity posttranslationally［J］. J Mol Biol, 2000, 303, 7-23.［5］Küppers R. B cells under influence: Transformation of B cellsby epsteinbarr virus［J］．Nat Rev Immunol,2003,10(3):801-812.［6］Han H, Tanigaki K, Honjo T, et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding proteinJ reveals its essential role in T versus B lineage decision ［J］. Int Immunol，2002,14(6):637-645.［7］Zhou S F, Fujimuro M, James J, et al. A role for SKIP in EBNA2 activation of CBF1repressed promoters ［J］. J Virol, 2000,74(4): 1939-1947.。
常用抗凝剂的配制及用法在医学实验中常需动物的全身抗凝，采出的全血或血浆有的也需加入适当的抗凝剂抗凝。
对抗凝剂的要求是：用量少、溶解度大、不带进干扰实验的杂质。
一、肝素（1）肝素抗凝作用原理肝素的抗凝作用很强,作死亡复苏等实验时，常用它作动物全身抗凝剂,肝素的抗凝作用主要是抑制凝血致活酶的活力，阻止血小板凝聚以及抑制抗凝血酶等作用，从而使血液不发生凝固。
注意事项:做全血DNA提取的时候抗凝剂不能采用肝素！因为肝素是聚合酶链式反应的抑制剂！（2)配制和用量纯的肝素10mg能抗凝65~125 ml血液（按lmg等于125U，10～20U能抗1 ml血液计).但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，因而其抗凝效果也不相同。
一般可配成1％肝素生理盐溶液，用时取0．1毫升于试管内,100℃烘干，每管能抗凝5～10ml血液。
也可将抽血注射器用配好肝素湿润一下管壁，直接抽血至注射器内而使血液不凝。
在动物实验作全身抗凝时，一般剂量为：大白鼠2．5~3．0mg/200～300g体质量，兔10mg／kg体质量，狗5～10mg／kg体质量。
肝素可改变蛋白质等电点,因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时,不可采用肝素。
市售的肝素钠溶液每毫升含肝素12500U，相当于100mg。
二、草酸盐合剂（1）原理草酸胺能使血细胞略为膨大,而草酸钾能使血细胞微缩小,因此草酸铵与草酸钾按3:2比例配置，可使血细胞体积保持不变；加福尔马林则能防止微生物在血中繁殖。
此抗凝剂最适于作红细胞比积测定。
（2）配制方法及用量草酸铵1．2g、草酸钾0．8g、福尔马林1．0ml、蒸馏水加至100ml每毫升血加草酸盐合剂0．1ml(即相当草酸铵1．2mg,草酸钾0．8mg）。
根据取血量将计算好的草酸盐剂量加入玻璃容器内烤干备用。
如取0．5ml于试管,烘干后每管可使5ml血不凝固.（3)注意事项草酸的作用在于能够沉淀血凝过程中所必需的钙离子，而达到抗凝目的.用时注意加的量应适中，不能过多,以免妨碍去蛋白质血滤液的制取.不适用于血液内钙或钾的测定,也不能用于血液非蛋白氮测定。
医学免疫学模拟练习题与参考答案一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.用针对哪个CD分子的单克隆抗体可以分离出B淋巴细胞A、CD80B、CD86C、CD81D、CD79aE、CD19正确答案：E2.关于生发中心的FDC,以下说法正确的是A、这是B细胞分化中的一个阶段B、这是一种脂肪细胞C、始终与T细胞接触D、这是具备抗原提呈能力的DCE、可将抗原浓缩、滞留在细胞表面正确答案：E3.关于巨噬细胞抗肿瘤作用的描述,错误的是A、可特异杀伤肿瘤细胞B、作为抗原提呈的APCC、分泌TNF、NO等细胞毒性因子间接杀伤肿瘤细胞D、巨噬细胞表面有Fc受体,可通过特异性抗体介导的ADCC效应杀伤肿瘤细胞E、非特异吞噬和杀伤肿瘤细胞正确答案：A4.适于分离纯化T淋巴细胞的方法是A、密度梯度离心B、亲和层析C、电泳分离D、FACSE、沉降法正确答案：D5.Graves病的自身抗原是A、基底膜Ⅳ型胶原B、促甲状腺素受体C、细胞核成分D、甲状腺球蛋白E、血小板正确答案：B6.TNF-α主要由哪种细胞产生A、单核-巨噬细胞B、初始T细胞C、B细胞D、树突状细胞E、红细胞正确答案：A7.DC通过分泌何种细胞因子激活Th1细胞A、IL-12B、IL-10C、IL-2D、Il-3E、IL-4正确答案：A8.哪种来源的肿瘤在不同个体或不同组织中表达相同的抗原A、所有的肿瘤B、病毒诱发的肿瘤C、化学致癌物诱发的肿瘤D、放射线辐射诱发的肿瘤E、后天免疫缺陷导致的肿瘤正确答案：B9.MHCⅠ类分子抗原提呈途径中,负责转运抗原肽进入内质网的分子是A、LMPB、TAPC、CLIPD、HLA-DME、Ii正确答案：B10.体内执行抗肿瘤免疫监视作用的固有免疫细胞是A、Tc细胞(CTL)B、NK细胞C、LAK细胞D、巨噬细胞E、调节性T细胞正确答案：B11.肿瘤的被动免疫治疗选用A、增强抗体B、紫杉醇C、抗独特型抗体瘤苗D、卡介苗E、TIL正确答案：E12.以下试验中涉及两对抗原抗体反应的是A、肥达试验B、Coombs试验C、直接免疫荧光D、免疫比浊E、间接凝集试验正确答案：B13.过客白细胞A、受者的树突状细胞B、受者的T细胞C、受者的B细胞D、供者的T细胞E、供者的树突状细胞正确答案：E14.血清中检出高效价抗核抗体多见于A、甲状腺肿大B、重症肌无力C、系统性红斑狼疮D、多发性骨髓瘤E、自身免疫性溶血性贫血正确答案：C15.T细胞发育成熟的场所是A、骨髓B、淋巴结C、胸腺D、血液E、感染部位正确答案：C16.肿瘤发生的主要机制是A、免疫调节功能的障碍B、免疫防御功能的障碍C、免疫功能亢进D、免疫监视功能的障碍E、免疫自稳功能的障碍正确答案：D17.以下分类正确的是A、白喉毒素属于TI-1抗原,LPS属于TI-2抗原B、白喉毒素属于TI-2抗原,LPS属于TI-1抗原C、白喉毒素属于TD抗原,LPS属于TI-2抗原D、白喉毒素属于TI-1抗原,LPS属于TD抗原E、白喉毒素属于TD抗原,LPS属于TI-1抗原正确答案：E18.免疫隔离部位的T细胞克隆处于何种状态A、克隆无能B、克隆消除C、阴性选择D、免疫隔离部位E、免疫忽视正确答案：E19.可用于检测人类B细胞功能的实验是A、E花环试验B、溶血空斑试验C、肥达氏反应D、结核菌素试验E、乳酸脱氢酶释放法正确答案：B20.一男孩因外伤损伤左眼球,手术后不久左眼球出现红肿热痛等炎症反应症状,该眼球局部的炎症反应针对的抗原属于A、自身抗原B、同种异型抗原C、异种抗原D、异嗜性抗原E、独特型抗原正确答案：A21.胞质区含有ITIM,与B7结合后可抑制T细胞活化的CD分子是A、CD3B、CD28C、CD4D、CD8E、CD152正确答案：E22.特异性免疫治疗不包括A、细胞因子治疗B、抗体导向化学疗法C、抗毒素血清治疗D、免疫毒素疗法E、细胞因子拮抗治疗正确答案：A23.半抗原的特性是A、不具有免疫反应性和免疫原性B、同时具有免疫原性和免疫反应性C、具有免疫反应性而不具有免疫原性D、具有免疫原性而不具有免疫反应性E、含有多个抗原表位正确答案：C24.个体甄别是依据HLA分子的A、肽结合区B、跨膜区C、胞浆区D、Ig样区E、单体型正确答案：A25.诱导Th0向Th17分化的细胞因子A、IL-4B、TGF-βC、TGF-β和IL-6D、IFN-γ和IL-12E、IL-16和IL-21正确答案：C26.巨噬细胞表面可识别病原菌表面岩藻糖残基的分子是A、清道夫受体B、Toll样受体C、CD14分子D、甘露糖受体E、调理性受体正确答案：D27.介导Ⅰ型超敏反应速发相的最主要介质是A、肝素B、白三烯C、组胺D、腺苷酸环化酶E、血小板活化因子正确答案：C28.初始T细胞表达哪些MHC分子A、MHCⅠ、Ⅱ、Ⅲ类分子B、MHCⅠ、Ⅱ类分子C、MHCⅠ、Ⅲ类分子D、MHCⅡ类分子E、MHCⅠ类分子正确答案：E29.巨噬细胞的功能不包括A、分泌细胞因子介导炎症反应B、免疫调节作用C、激活后特异性杀伤肿瘤细胞D、处理提呈抗原,启动特异性免疫应答E、吞噬杀伤作用正确答案：C30.能形成生发中心的部位是A、胸腺B、血液C、淋巴结D、骨髓E、感染部位正确答案：C31.与鼻咽癌发生有关的是A、CMVB、HBVC、HPVD、EBVE、SV40正确答案：D32.从抗原化学性质来讲,免疫原性最强的是A、脂多糖B、多糖类C、核酸D、DNAE、蛋白质正确答案：E33.抗体抗肿瘤的机制不包括A、增强抗体的作用B、ADCCC、调理作用D、CDCE、封闭肿瘤细胞上的转铁蛋白受体正确答案：A34.同卵双生的兄弟间进行的肾脏移植,属于A、自体移植B、人造器官移植C、同系移植D、异种移植E、同种(异体)移植正确答案：C35.胶体金用于免疫电镜的优点是A、可用于疾病的快速诊断B、可用于对组织抗原的定量检测C、反应不受酸碱度影响D、较其他标记物更敏感E、可以用不同大小的颗粒对样本进行多重标记正确答案：E36.眼葡萄膜色素是A、同种异型抗原B、肿瘤相关抗原C、自身抗原D、半抗原E、异嗜性抗原正确答案：C37.采用标记抗体进行检测的试验是A、ABO血型鉴定B、E玫瑰花结形成试验C、单向琼脂扩散D、趋化功能检测E、免疫组化技术正确答案：E38.关于记忆B细胞,下列说法错误的是A、合成大量IgMB、接触同一抗原可迅速活化C、在生发中心形成D、与静息B细胞的大小相似E、介导B细胞的再次免疫正确答案：A39.成熟DC不具有以下哪些特点A、高表达MHCⅡ类分子B、高表达共刺激分子C、能活化初始T细胞D、摄取加工抗原的能力强E、提呈抗原的能力强正确答案：D40.高剂量抗原诱导产生耐受的细胞是A、B细胞B、T细胞C、B细胞和T细胞D、NK细胞E、巨噬细胞正确答案：C41.去除病原体中与激发保护性免疫无关的成分,保留有效免疫原成分制作的疫苗称为A、重组抗原疫苗B、结合疫苗C、灭活疫苗D、类毒素E、亚单位疫苗正确答案：E42.肿瘤过继性细胞免疫治疗A、单克隆抗体结合的蓖麻毒素B、灭活瘤苗C、5-氟尿嘧啶D、卡介苗E、肿瘤浸润淋巴细胞正确答案：E43.能与免疫球蛋白Fc段补体结合点相结合的补体成分是A、C4B、C1qC、C1rD、C1sE、C2正确答案：B44.重组乙型肝炎病毒表面抗原疫苗属于A、结合疫苗B、重组抗原疫苗C、亚单位疫苗D、灭活疫苗E、合成肽疫苗正确答案：C45.关于TI-2抗原说法错误的是A、细菌胞壁是TI-2抗原B、荚膜多糖是TI-2抗原C、对TI-2抗原应答的主要是B2细胞D、仅能激活成熟B细胞E、不能诱导抗体亲和力成熟正确答案：C46.以下关于补体系统的描述正确的是A、包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白B、是存在于人和脊椎动物血清与组织液中的一组耐热蛋白质C、属于固有免疫系统成分,不参与特异性免疫应答D、本身具有酶活性,不需要活化的一组蛋白质E、与炎症反应无关正确答案：A47.介导Ⅰ型超敏反应的免疫球蛋白是A、IgMB、IgGC、IgED、sIgAE、mIgD正确答案：C48.向B细胞传递共刺激信号的分子A、ICAM-1(CD54)B、CD79a/CD79bC、CD40D、CD80/CD86E、CD19/CD21/CD81正确答案：C49.患者,男,52岁。
