人非小细胞肺癌细胞EGFR基因启动子甲基化与吉非替尼敏感性之间的相关性研究

２０１２年９月第１７卷第９期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｌｉｎｉｃ　ａｌ　ｎ—ｃｏ—ｌｏｇＹ　兰ｅｐ．　！：　！　：　

人非小细胞肺癌细胞ＥＧＦＲ基因启动子甲基化　

与吉非替尼敏感性之间的相关性研究　

２１０００９　南京　南京医科大学附属肿瘤医院肿瘤内科　

孙俊杰，吴建中，陆建伟，曾海霞，马　蓉，冯继锋　・７６９・　

著・　

【摘要】　目的探讨ＥＧＦＲ基因启动子甲基化水平与人非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）细胞株对吉非替尼敏感性之间的相　关性。方法用不同浓度吉非替尼分别作用于ＮＳＣＬＣ细胞株ＨＣＣ８２７、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、Ｈ３５８、Ｈ１２９９、Ａ５４９后，ＣＣＫ一８法检测细　胞增殖抑制率，ＤＮＡ直接测序法、实时荧光定量ＰＣＲ法、免疫印迹法和甲基化特异性ＰＣＲ法分别检测上述ＮＳＣＬＣ细胞株ＥＧ—　ＦＲ基因突变、ＥＧＦＲ　ｍＲＮＡ、ＥＧＦＲ蛋白表达和启动子区甲基化状态。结果ＣＣＫ一８法检测结果显示，１９外显子缺失突变的　ＨＣＣ８２７细胞对吉非替尼最敏感，而同为ｌ９外显子缺失突变的Ｈ１６５０细胞对吉非替尼不敏感；野生型的Ｈ３５８细胞对吉非替　尼中度敏感，其敏感性甚至超过１９外显子突变的Ｈ１６５０细胞，而同为ＥＧＦＲ野生型的Ｈ１２９９、Ａ５４９细胞对吉非替尼敏感性较　差。吉非替尼处理７２ｈ后，ＨＣＣ８２７细胞与Ｈ３５８细胞相比、ＨＣＣ８２７细胞和Ｈ３５８细胞与其他４株细胞相比，Ｉｃ　。值均有显著性　差异（Ｐ＜０．０５）。ＨＣＣ８２７细胞ＥＧＦＲ启动子为未甲基化状态，其ＥＧＦＲ蛋白和ｍＲＮＡ表达最高；Ｈ３５８细胞为部分甲基化，其　ＥＧＦＲ蛋白和ｍＲＮＡ为中等表达；其他４个细胞株均为高甲基化状态，ＥＧＦＲ蛋白和ｍＲＮＡ呈低表达；ＨＣＣ８２７细胞的ＥＧＦＲ　表达水平较Ｈ３５８细胞高，ＨＣＣ８２７和Ｈ３５８细胞的ＥＧＦＲ表达较其他４个细胞株高，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　ＥＧＦＲ基因启动子区高甲基化可能下调ＥＧＦＲ基因的表达水平，从而降低ＮＳＣＬＣ对吉非替尼的敏感性；对该基因的甲基化检　测可能对预测吉非替尼治疗ＮＳＣＬＣ疗效有一定的临床指导意义。　

【关键词】　非小细胞肺癌；表皮生长因子受体；ＤＮＡ甲基化；吉非替尼　中图分类号：Ｒ７３４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—０４６０（２０１２）０９—０７６９—０６　

ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ＳＵＮ　Ｊｕｎ－ｊｉｅ，ＷＵ　Ｊｉａｎ—ｚｈｏｎｇ，ＬＵ　Ｊｉａｎ—ｗｅｉ，ＣＡＯ　Ｈａｉ—ｘｉａ，ＭＡ　Ｒｏｎｇ，ＦＥＮＧ　Ｊｉ－ｆｅｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｎｎ咏ｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００９，Ｃｈｉｎａ　

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＦＥＮＧ　Ｊｉ　ｎｇ，Ｅ—ｍａｉｌ捌＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　ｉｎ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＣＣ８２７，Ｈ１６５０，Ｈ１９７５，Ｈ３５８，Ｈ１２９９　ａｎｄ　Ａ５４９　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ一８（ＣＣＫ一８）ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎｄ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＥＧＦＲ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ：ＨＣＣ８２７　ａｎｄ　Ｈ１６５０　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｏｎ　１９　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ；Ｈ１９７５　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｏｎ　２１　Ｌ８５８Ｒ　ｐｏｉｎｔ　ａｎｄ　ｅｘｏｎ　２０　Ｔ７９０Ｍ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　Ｈ３５８，Ｈ１２９９，Ａ５４９　ｗｅｒｅ　ａｌｌ　ｗｉｄｅ　ｔｙｐｅ　ｃｅｌｌｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　５０％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＩＣ５ｏ），ｔｈｅ　ＨＣＣ８２７　ｗａｓ　ｍｏｓｔ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｇｅｎｆｉｔｉｎｉｂ　ａｎｄ　Ｈ５３８　ｗａｓ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．ｗｈｉｌｅ　Ｈ１６５０　ｗａｓ　ｎｏｎ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｈ１２９９　ａｎｄ　Ａ５４９　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｇｅｎｆｉｔｉｎｉｂ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　ＨＣＣ８２７　ａｎｄ　Ｈ３５８　ｃｅｌｌｓ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｆｏｕｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔ—　ｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｗａｓ　ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｉｎ　ＨＣＣ８２７　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐａｒｔｌｙ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｉｎ　Ｈ３５８　ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｌｅ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｆｏｕｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ＇ａｌｌ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕ－　ｓｉｏｎ　ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｍａｙ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　ｉｎ　ＮＳＣＬＣ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ＥＧＦＲ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍａｙ　ｈａｖｅ　ｄｅｆｉｎｉｔｅ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕ—　ｔｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．　

基金项目：江苏省科技厅科研基金资助项目（ＢＫ２００９４４６）；吴阶平医学基金资助项目（３２０．６７００．０９０５０）　１　通讯作者．Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｊｉｆ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ　ＣＯＩＩ１

　・７７０・　志２０１２年９月第１７卷第９期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏ￣ｗ．ＳｅＰ．２０１２．Ｖｏ１．１７．Ｎ０．９　

【Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ】Ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　

近年来，新型靶向治疗药物的问世使晚期非小　细胞肺癌（ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）的治　

疗取得了突破性的进展。其中以吉非替尼（ｇｅ．　ｆｉｔｉｎｉｂ）为代表的表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　

ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）的酪氨酸激酶抑制剂　（ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＴＫＩ）是目前最成功应用　

于ＮＳＣＬＣ治疗的小分子靶向药物之一，其通过竞争　性地与ＥＧＦＲ酪氨酸激酶的催化区域中Ｍｇ　ＡＴＰ位　

点结合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻断ＥＧＦＲ的信号　转导通路…，从而抑制肿瘤浸润和转移。ＥＧＦＲ—ＴＫＩ　

治疗的主要优势人群是ＥＧＦＲ基因突变的患者，其　有效率约为７５％，而ＥＧＦＲ基因野生型的有效率为　１０％［２－３］。显然，在临床实践中仅以ＥＧＦＲ基因突变　

来筛选ＥＧＦＲ—ＴＫＩ的适用人群有一定的局限性，能　否使更多的患者从新的分子靶向治疗中获益呢？　表观遗传学的研究逐渐成为新的热点，ＤＮＡ甲　

基化是最重要的一种表观遗传修饰方式。一系列　

的研究表明，肿瘤发生过程中存在着许多特异性的　异常甲基化，这有可能成为肿瘤诊断、治疗的分子　标志物。在大量实体瘤中发现启动子区ＣｐＧ岛的　胞嘧啶甲基化是基因失活的重要分子机制　。　，由　

于ＥＧＦＲ基因ＤＮＡ启动子区含有ＣｐＧ岛及调节位　点（如Ｓｐ　１　ｓｉｔｅ），其表达受ＤＮＡ启动子区甲基化的　

调控。因此我们推断ＥＧＦＲ启动子区的甲基化可能　调控其基因表达，改变ＥＧＦＲ—ＴＫＩ的治疗靶点，影响　

吉非替尼对ＮＳＣＬＣ的疗效。　

１材料与方法　

１．１　材料　人ＮＳＣＬＣ细胞株ＨＣＣ８２７、Ｈ１９７５、　Ｈ１６５０、Ｈ１２９９、Ｈ３５８、Ａ５４９购自中国科学院上海细　胞生物学研究所；ＲＰＭＩ．１６４０培养基、胎牛血清　

（ＦＢＳ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；活细胞计数试剂盒　（ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ一８，ＣＣＫ．８）购自日本株式会社同仁　

化学研所；Ｍｅｔｈｙｌｃｏｄｅ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｋｉｔ、总　ＲＮＡ抽提试剂Ｔｒｉｚｏｌ均购白美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；逆　

转录试剂盒购自德国Ｑｉａｇｅｎ公司；ＥＧＦＲ探针引物　（Ｈｓ０１０７６０９２　ｍ１）和ＧＡＰＤＨ探针引物（Ｈｓ９９９９９９０５　

一ｍ１）购自美国ＡＢＩ公司；ＲＩＰＡ蛋白裂解液购自美　国Ｂｉｏｍｉｇａ公司；兔抗人ＥＧＦＲ多克隆抗体、兔抗人　

１３－ａｃｔｉｎ多克隆抗体均购自英国Ａｂｃａｍ公司，辣根过　氧化物酶标记羊抗兔ＩｇＧ抗体购自丹麦Ｄａｋｏ公司；　５－ａｚａ—ＣｄＲ和碘化丙啶（ＰＩ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司。　吉非替尼片由英国Ａｓｔｒａ　Ｚｅｎｅｃａ公司提供，去除糖　衣后溶解于ＤＭＳＯ，制成浓度为２．５　Ｘ　１０　ｐ，ｍｏｌ／Ｌ的　

溶液，分装保存于一２００Ｃ冰箱中备用，实验时用培养　液稀释至目标浓度，使终溶液中ＤＭＳＯ体积分数　

＜０．００５％。　１．２　细胞培养６种ＮＳＣＬＣ细胞株分别贴壁生长　于ＲＰＭＩ一１６４０培养基，内含１０％胎牛血清及青、链　

霉素１００Ｕ／ｍｌ，置于３７℃、５％ＣＯ　饱和湿度培养箱　内传代培养，每隔３～４ｄ传代１次，取处于活跃增殖　期的细胞用于实验。　

１．３　ＤＮＡ直接测序法检测ＥＧＦＲ基因突变　常规　提取、纯化ＤＮＡ，用ＡＢＩ３５００遗传分析仪进行测序，　

Ｄａｔａ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ软件自动进行数据处理和分析。将６　种ＮＳＣＬＣ细胞株的序列用ＡＢＩ　ＳｅｑＳｃａｐｅ软件与　Ｇｅｎｅｂａｎｋ标准序列进行比对，观察其基因序列的　

改变。　１．４　ＣＣＫ一８法测定细胞增殖抑制率　取上述６种　对数生长期细胞经胰酶消化后吹打成单细胞悬液，　以１×１０　个／ｍｌ的细胞浓度接种于９６孔培养板中，　每孔１００￣１。细胞贴壁后，分别加人不同浓度的吉