体内药物分析方法(精)

4. 与参比方法的相关性 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系 良好的色谱法。
例：茶碱血浆样品用UV法和HPLC法测定结果的相关 性
HPLC
茶 14 碱 血 12 浆 样 品 10 用
8
法6 测 定4 的 结 果2
.
.
. Y=－0.107＋0.983X
.
(r=0.9591，n=9)
. .
. ..
分析方法的建立步骤： 第一步：检测条件的筛选
以待测药物对照品照拟定的分析方法 （预处理除外）测定。根据测定结果确定最 佳分析检测条件。
例：HPLC－检测器、色谱柱、流动相、柱 温、内标；使具有足够的方法灵敏度、良好 的色谱参数（n，R，T）、适当保留时间。
第二步：分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物 基质中内源性物质及代谢产物对分离与检 测的干扰；确认以对照品确定的检测条件 是否适用于实际生物样品。
分析测定的目的与要求
根据体内药物分析的目的决定分析方法的应用 1. 药代动力学研究
要求: 同时测定原形药物和代谢产物 检测: 宽线性范围（Cmax~Cmax的1/20）、高灵敏
度（10-9g/ml）和高专属性 方法: 不必强调方法的简便、快速；重点考虑测定 浓度范围较宽；多采用HPLC、GC-MS、LC-MS
考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干 扰情况，进一步验证方法的可行性。
分离条件选择色谱图：
第三节 分析方法验证的内容与要求
验证分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法所有可变 因素（采样，样品制备，色谱分离，检测 与数据评价），通常采用模拟生物样品和 实际生物样品。
分析方法验证的内容：
SD
n

于批量自动化检测
第一节 体内药物分析的目的和意义
1、生物样本分析方法的建立 2、生物样本的测定
3、药物的体内研究评价
第一节 体内药物分析的目的和意义
给药方案与效应关系
给药
药代动力学
药物
ADME
药效学
药物效 应与不 良反应
药物进入机体后，产生的两种不同的效应。
体内药物分析概述
二、体内药物分析的对象
临床人体 试验
(clinical）
非临床动 物试验 (preclinical
血液
药物代 谢物
尿液
常用样 本种类
唾液
头发
粪便
体内药物分析概述
三、体内药物分析特点
➢ 干扰物质多，内源性物质多，与药物有结合、缀合，需 经过分离、纯化。
➢ 样品浓度低，测定前需浓缩、富集。 ➢ 取样量少 ➢ 工作量大 ➢ 对仪器设备要求高（如需要样本冷贮、萃取、离心、富
特点
优缺点
• 优点: 样本易得，样品量 大; 尿液中药物浓度较高， 易于检测；无需去蛋白处 理。
• 缺点: 易受食物种类、饮 水多少、排汗情况等的影 响，个体差异常常很大。
• 直接测定，萃取 分离测定
• 采用化学方法或 酶解法游离缀合 状态药物。
尿样的 尿样的 制备 采集
• 自然排尿法
• 随时尿、晨尿、白天 尿、夜间尿、及特定 时间段尿液。
阐明药物在体内ADME过程和 特点，提供药动学参数，揭示 药物在体内动态变化的规律性
阐明代谢物的结构、转化途径 及其动力学
为药效学和毒理学评价提供重 要的线索
目的
药物研发过程中的体内药物试验和分析
体外PK/PD 动物PK/PD
毒性

体内药物分析(2)
生物样品的前处理方法
(一)去除蛋白质
在测定血样时，首先应去除蛋白质。

去除蛋白质可使结合型的药物游离出来，以便测定药物的总浓度;去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能(如保护HPLC柱不被沾污)，延长使用期限。

去除蛋白法有以下几种。

1.加入与水相混溶的有机溶剂
可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。

常用的水溶性有机溶
剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。

2.加入中性盐
使溶液的离子强度发生变化。

中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。

常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。

体内药物分析体内药物分析:药物分析的的重要分支，是研究生物体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。

体内药物分析的特点◆生物样品基质复杂◆被测物浓度低◆分析方法要求高◆实验室仪器设备要求高◆测定目标与数据处理复杂体内药物分析方法的要求◆高灵敏度检测方法的应用◆建立高选择性、高专属性的分离方法◆建立的分析方法满足于分析目的相适应的精密度和准确度要求成分复杂、干扰众多——要求方法选择性高采样量小，浓度很低——要求方法灵敏度高原料药：容量分析为主制剂：仪器分析为主体内药物：高灵敏度；高选择性的方法第二章生物样品指含待测物质的生物基质最常见的生物基质为血液，最常用的生物样品是血浆或血清血样采集的时间、方式：血样的应用：血样包括全血、血浆、血清全血不能作为作用部位药物浓度的可靠指标，通常指测定血浆或血清中的药物的浓度。

当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品血样制备的差异：尿液：尿液中必须加入防腐剂，非损伤性采样方法唾液：组织：头发：微量元素的测定生物样品的贮存：◆血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃◆冷冻是最常用的生物保存方法◆生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻分析样品制备的目的：◆使药物从缀合物或结合物中释放，测定总浓度◆使样品纯化与药物组分富集◆满足测定方法对分析样品的要求◆保护仪器性能及改善分析条件有机破坏法主要应用于头发样品中金属元素的测定去除蛋白质法去除蛋白质目的：溶剂解法：◆常用溶剂——甲醇、丙醇◆原理——◆操作——盐析法：中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白脱水而沉淀）强酸沉淀法：10％三氯醋酸、6％高氯酸超滤法：不需加热，不需添加化学试剂、操作条件温和，没有相态变化，破坏性小，能耗少，工艺流程短。

酶水解法：避免酸碱、高温降解，改善回收率，无乳化，减少净化操作纯化与浓集应用范围：液－液提取法（LLE）大多数药物都是脂溶性，内源性物质基本上都是水溶性，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化目的优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大的化合物的萃取效率低固相萃取(SPE)◆原理：根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。