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手性药物的色谱制备拆分技术1李燕1，何彬1, 21.桂林医学院药学院，广西桂林 (541004)2.四川大学华西药学院，成都 (610041)E-mail：yanli@摘要：本文将近年来应用于手性药物拆分的色谱技术进行了整理、概括，着重比较了它们在制备规模上的优缺点。
尽管各种色谱拆分技术在手性药物的拆分上都有应用，但就工业制备来说，HPLC、SMB、SFC最有前景。
色谱技术在手性药物的制备拆分领域将发挥越来越重要的作用。
关键词：手性药物，拆分，色谱技术，综述中图分类号：O6 化学1. 引言手性是自然界的本质属性之一。
生命体系就是一个手性环境，生物体的基本组成成分蛋白质、多糖、核酸、酶等几乎都是手性的。
20世纪60年代震惊世人的沙利度胺事件证实了手性药物的不同对映体间往往显示出不同的药理学、毒理学及药代动力学性质。
为了保证用药安全，美国FDA1992年就发布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的消旋体新药的生产着均需提供有关报道，说明药物中所含对映体的各自药理作用、毒性和临床效果。
据相关统计数据，2002年全球500种畅销药物中手性化学品药物有289种，占59%。
专家预测，2010年世界手性化学品药物总销售额可望超过2500亿美元。
手性化合物的获得一般可以通过手性合成和手性拆分两种途径。
手性合成不但步数多，产率不高，至今还未得到广泛的应用。
因此，目前大约65%非天然对映体药物是都是通过手性拆分的方法制造的。
手性拆分技术主要包括：结晶法、色谱法、膜法、手性萃取等。
其中色谱法因其快速、高效、成本相对低等优势而得到广泛的应用。
本文综述了几种色谱拆分方法，侧重比较了它们在工业领域中进行生产的优缺点和可能性。
2. 液相色谱2. 1高效液相色谱（HPLC）HPLC在拆分对映体时通常有三种方法：1）利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性HPLC所拆分；2）在流动相中加入手性添加剂，利用非手性固定相HPLC进行拆分；3）利用手性固定相（Chiral Stationary Phase，简称CSP）的HPLC进行拆分。
lcmsms的开发流程
LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱法）的开发流程概括如下：
1. 方法设计：根据待测物性质选择合适的液相色谱条件，如色谱柱类型、流动相体系、梯度洗脱程序等；同时确定质谱参数，如离子源类型、母离子及子离子的选择、碰撞能量等。
2. 标准品制备：配制含有待测物的标准溶液系列，用于绘制校准曲线和方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度验证。
3. 方法优化：通过反复实验调整液相色谱和质谱条件，优化待测物的分离度和离子化效率，确保最佳检测性能。
4. 方法验证：按照法规或实验室标准，对方法进行特异性、线性、准确度、精密度、检测限和定量限等各项性能验证。
5. 样品前处理：制定样品提取、净化、浓缩等步骤，并验证前处理方法的回收率和干扰消除效果。
6. 应用与验证：在实际样品中应用开发的方法进行分析，确认方法在复杂基质中的适用性及可靠性。
整个流程需结合实验数据反馈不断迭代优化，最终建立稳定的LC-MS/MS分析方法。
如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物样品分析方法?前言：以前曾在实验室的seminar上，做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。
时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛，在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。
首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。
药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们所说的“生物样品” (Biosample)。
生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS，更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？下面我主要从以下四个方面进行阐述：一、色谱-质谱条件的确立1、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。
虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的，基本原理如图所示。
我们在确定方法时，主要考虑以下几个因素：（1）化合物的性质：包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。
首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的pKa值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。
（2）流动相添加剂的选择：在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。
但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。
在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图一。
1. 适用范围适用于LC/MS/MS农药的一齐分析法（Ⅱ）中农药的检测。
2. 编制依据依据日本厚生劳动省《LCMS农药一齐分析法Ⅱ》编制。
3. 方法原理水果、蔬菜、加工产品中的农药残留经乙腈提取，提取溶液经净化、浓缩用50%的甲醇定容后，LC/MS/MS测定，用外标法定量。
4. 试剂4.1 乙腈：色谱级4.2 丙酮：色谱级4.3 正己烷：色谱级4.4 乙酸乙酯：色谱级4.5 无水硫酸钠：分析纯4.6 甲苯：色谱级4.7甲醇：色谱级4.8 氯化钠：分析纯4.9 0.01M 盐酸：8.29ml浓盐酸定容至1000ml5. 仪器设备5.1 Waters UPLC TQD5.2 食品加工器5.3菜刀，案板5.4电子天平5.5均质机5.6布氏漏斗，分液漏斗，普通漏斗，滤纸5.7梨形瓶（250ml，100ml）5.8 锥形瓶（200ml，100ml）5.9 C18固相萃取柱（1G 6ml）5.10氨基复合柱（Carbon/NH2 500mg 6ml）5.11硅胶柱Silica （500mg 6ml）5.12旋转蒸发仪5.13 氮吹仪5.14 玻璃离心管（10mL）5.15 分液漏斗振荡器5.16 真空泵5.17 移液枪（1mL，200μL）6. 分析步骤6.1 试料的制备：（除不加样品外，试剂空白与样品同步处理）将送交实验室的不少于500克的样品于食品加工器搅细（对于大块状的样品可先用水果刀切成小块，再放于食品加工器中搅细）。
粉碎后的样品装于一次性的塑料袋中备用。
6.2 提取6.2.1 准确称取10.0g（精确到0.1g）搅细的样品（原料称取20.0g）于均质杯中，加入70ml乙腈，在高速组织捣碎机中均质5min。
6.2.2 将样品减压抽滤，用30ml乙腈冲洗均质杯，也过滤，合并滤液。
6.2.3 将滤液倒入装有7gNaCl的300ml分液漏斗中，用20mL0.01M 盐酸冲洗三角瓶，也倒入分液漏斗中，在分液漏斗震荡器上剧烈震荡10min，静置10min，使乙腈相和水相分层。
LCMSMS农药一齐分析法简介：LC-MS/MS是一种基于液相色谱联用串联质谱的分析技术，广泛应用于农药残留监测领域。
它具有高灵敏度、高选择性和高效率的优点，可以实现多种目标物同时检测和定量。
LC-MS/MS农药一齐分析法的原理：该分析方法首先通过液相色谱将样品中的目标物进行分离，然后经过串联质谱仪的产物离子扫描模式进行检测和定量。
在这种分析方法中，每个目标物都有一个特定的质谱图，通过与事先建立的质谱库中的标准谱进行比对，可以确定每个目标物的含量。
方法的步骤：1.样品的制备：将样品加入适量的溶剂中，并通过固相萃取或液-液萃取等方法将目标物提取出来。
然后使用气相色谱或高效液相色谱等方法对提取物进行净化和预处理。
2.样品的进样：将制备好的样品注入液相色谱系统中，通过自动进样器进行进样。
3.液相色谱的分离：使用液相色谱系统进行目标物的分离。
选择合适的色谱柱和流动相进行优化，以达到理想的分离效果。
4.串联质谱的检测：将液相色谱分离得到的目标物进入串联质谱仪进行检测和定量。
在质谱检测中，使用多反应监测（MRM）模式进行目标物的筛选和定量。
5.数据处理和结果分析：使用专业的数据处理软件对得到的质谱数据进行处理和分析，计算出每个目标物的浓度，并与质谱库中的标准谱进行比对确定目标物的含量。
LC-MS/MS农药一齐分析法的优点：1.高灵敏度：LC-MS/MS技术可以在低浓度下检测和定量目标物，其灵敏度通常比传统的色谱方法高几个数量级。
2.高选择性：通过质谱仪的选择离子模式和多反应监测模式，可以有效地排除样品中的干扰物，提高分析的选择性。
3.高效率：LC-MS/MS技术可以实现多种目标物的一齐分析，大大提高分析效率和样品通量。
4.宽线性范围：LC-MS/MS技术的线性范围通常较宽，可以适应不同浓度范围内目标物的测定需求。
总结：LC-MS/MS农药一齐分析法是一种高效、高灵敏度和高选择性的分析技术，在农药残留监测和食品安全领域具有重要的应用价值。
药物研究中手性分离分析方法及技巧手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。
液相色谱法成为目前手性药物分离测定的首选方法，根据实际工作中需要的手性分离问题，总结如下：1、流动相手性分析很关键的一项是流动相的选择，手性分析一般都采用正相，使用最多的流动相是正己烷、正庚烷、乙醇和异丙醇这四种，其中起洗脱作用的流动相是乙醇和异丙醇，正己烷和正庚烷用来调节流动相的洗脱强度。
正己烷和正庚烷对于样品分离没有什么太大的影响，不会改变选择性和分离度，通常都可以混用，不过正庚烷比正己烷对人体的伤害要小很多，但价格是后者的一倍，所以欧美的很多大制药公司多使用正庚烷，而国内多使用正己烷。
乙醇和异丙醇对样品的分离起关键的作用，不同的醇有不同的选择性，改变醇的种类可以改变选择性，常用的醇类是乙醇和异丙醇，甲醇不能使用是因为它和正己烷、正庚烷不互溶，叔丁醇粘度太大，一般作为添加剂配合乙醇或者异丙醇少量使用，提供特殊的选择性，通常能起到意想不到的效果。
一般情况下分析手性样品，很多人推荐首选异丙醇，但是我喜欢首选乙醇，因为乙醇气味比异丙醇好一点，且乙醇做流动相压力要低一些，实际上二者差别不是太大。
流动相里经常需要添加酸或者是碱来调节峰形，常用的酸有三氟乙酸、乙酸和甲基磺酸，碱一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和异丁胺的，流动相里添加酸和碱的浓度一般要求控制在0.2%(体积比)以下，我们一般用0.1%，使用的原则一般是酸性样品加酸，碱性样品加碱，但实际上很多样品是即含酸性基团又含碱性基团，这就要看哪个基团作用强了，对于某些含氨基的两性样品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一个非常好的选择，磺酸基能够抑制氨基的碱性，又能提供一个酸性的流动相环境，使样品既能得到很好的分离又能获得对称的峰形。
一般做纯度分析检测杂质含量时我们要求尽量的采用低波长来让尽可能多的杂质有紫外吸收，而做手性分析时我们需要采用尽可能高的波长来去除在低波长下才有吸收的杂质的干扰，一般原则还是尽量选择样品紫外吸收最好的地方来获得较高的灵敏度，但流动相里添加二乙胺会导致在低波长下基线波动变大，系统难以平衡，这种情况下一般要提高检测波长，实际操作过程中有些样品在高波长下吸收非常差，只能用低波长检测，这样的样品可以尝试在样品稀释的时候加入过量的二乙胺(但不宜太多)，而流动相用中性，从而获得满意的分析结果。
LC-MSMS定量分析流程与经验LC-MS/MS定量分析流程与经验第一步： Q1 SCAN——确定母离子的质荷比●根据待测化合物性质，选择分析的极性(＋/－)、离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间●确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。
参数设置：扫描方式：Q1 Scan质量范围：Parameter Range，100～MW+30，t=1～2secCenter Width，MW±5Da，t=0.5sec通过手动调节DP、GS1，使喷雾平稳、有效第二步：Product Ion Scan ——确定子离子的质荷比●得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜●平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位参数设置扫描方式：Product Ion Scan质量范围：Parameter Range，50～MW+10，t=1～2sec通过手动调节CE第三步：优化化合物参数●根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对●选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间●用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD参数。
各离子对应分别设定。
●初步建立MRM方法●一般优化两次，以得到比较确切的结果第四步：方法转化：将连续进样方法→LC-MS方法●关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。
●单击Acquire中Build Acquire Method，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。
●设置色谱同步。
●设置色谱参数，分析时间一般为0.6～1min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。
第五步：FIA-优化Source参数●将前面用过的样品溶液稀释100～1000倍。
