质粒载体的构建
摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。
关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化
1.引言
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：
①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质
粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。
②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而
传给后代。
③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的
特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。
所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。
质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。
质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。
质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
2. 材料方法
2.1目的DNA的获得
2.1.1 引物设计
第一次引物设计：
正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a
引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’
引物长度：25bp
反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b
引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’
引物长度：22bp
第二次引物设计（带酶切位点）：
正向引物：sinn3FE 冰盒标注：P2c
引物序列：
5’—ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’引物长度：34bp
反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P2d
引物序列：
5’—TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’引物长度：34bp
2.1.2 PCR扩增
2.1.2.1 PCR技术的基本原理
PCR即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程.是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面.
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2 PCR反应的基本步骤:
1.变性: 高温使双链DNA解离成单链.（94℃ 30s）
2.退火:低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子.（55℃ 30s）
3.延伸:中温延伸. 在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下, DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链.（70-72℃30-60s）
以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n形式增加.
2.1.2.2 PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染
色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法
2.1.2.3 PCR反应体系
第一次PCR扩增:
调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb）: PCR反应体系2*100ul（每管25ul,共8管）
Pyrobest 2ul
buffer（10x） 10ul
WT4（模板） 2ul
P2a（10uM） 4ul
P2b（10uM） 4ul
dNTP（2.5x） 2ul
ddH2O 76ul
PCR反应条件:
94℃ 5min
30 cycles: 94℃ 40s
53℃ 40s
72℃ 2min30s
72℃ 10min
4℃ forever
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见2.1.3电泳）,切胶回收目的DNA条带,共切3管,分别标注A、B、C.首先用25ul约60℃的
无菌蒸馏水洗脱A管一次,洗脱液标注1,分别用15ul的无菌蒸馏水洗脱B管和C管,得到的DNA洗脱液标注2,最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管,得到的DNA洗脱液分别标注a、b、c.
第二次PCR扩增（带酶切位点）:
分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板,进行第二次PCR扩增,设计反应体系（各25ul）如下:
模板2 模板a 模板b 模板c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul
buffer（10x） 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul
模板 0.5ul 2ul 4ul 6ul P2a（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul
P2b（10uM） 1ul 1ul 1ul 1ul dNTP（2.5x） 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul ddH2O 19ul 17.5ul 15.5ul 13.5ul PCR反应条件:
94℃ 5min
30 cycles: 94℃ 40s
54℃ 40s
72℃ 2min30s
72℃ 10min
4℃ forever
电泳结果表明:以2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带,依据此次电泳结果,可先后再利用PCR扩增（各100ul,每管25ul,共8管）
PCR反应体系2*100ul（每管25ul,共8管）
模板2 模板c
Pyrobest 2ul 2ul
buffer（10x） 10ul 10ul
模板 4ul 40ul
P2a（10uM） 4ul 4ul
P2b（10uM） 4ul 4ul
dNTP（2.5x） 2ul 2ul
ddH2O 74ul 38ul
PCR反应条件:
94℃ 5min
30 cycles: 94℃ 40s
54℃ 40s
72℃ 2min30s
72℃ 10min
4℃ forever
电泳条带明显而且明亮,切胶回收保存待用.。
2.1.3 电泳
2.1.
3.1 配胶
①配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（1X TAE Buffer）
②根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉（1g）,加入适当的锥形瓶中。
③加入一定量的电泳缓冲液（1X TAE Buffer 100ml）。
④熔化完全，冷却至600C左右，加入EB5-7ul，充分混匀。
⑤将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。
⑥室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放40C
保存，一般可保存2-5天。
2.1.
3.2 电泳
取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的DNA Maker 加入右边槽中，开始电泳。
2.1.
3.3 紫外观察电泳条带
当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带（1kb处）
2.1.4 切胶回收目的DNA
切胶回收目的DNA的方法步骤：
操作流程见右图，全套操作约需30分钟，详细说明如下。
1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电
泳。
2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应
注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA 的回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向
胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer ，DR-I Buffer 的加量如
下表：
6. 均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶
只需在45℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块
充分融化（约6～10分钟）。
注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA
的回收率。
7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 量的1/2体
积量的DR-II Buffer ，均匀混合。当分离小于400 bp
的DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%
的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube
上。
9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column 中，3,600
rpm 离心1分钟（如Spin Column 中有液体残留，可
适当提高离心速度，再离心1分钟），弃滤液。
注）如将滤液再加入Spin Column 中离心一次，可
以提高DNA 的回收率。
10. 将500 μl 的Rinse A 加入Spin Column 中，3,600 rpm
离心30秒，弃滤液。
11. 将700 μl 的Rinse B 加入Spin Column 中，3,600 rpm
离心30秒，弃滤液。
12. 重复操作步骤11，然后12,000 rpm 再离心1分钟。
13.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入
25 μl的60℃水或洗脱液，室温静置1分钟。
14.12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.1.5 目的DNA加尾
用25ul的无菌蒸馏水洗脱DNA，再用20ul的无菌蒸馏水洗脱，共得约40ul的洗脱液，然后抽真空使其浓缩至约8ul。
加尾10ul体系：8ul DNA
1ul Buffer（10x）
0.5ul dATP
0.5ul Taq酶
PCR条件：72℃30-40min降至4℃即可
2.1.6 连接T-DNA
连接10ul体系：1 ul T4 ligase
1 ul Buffer（10x）
1 ul T-DNA
7 ul DNA-PolyA
连接条件：4000rpm甩30sec 4℃过夜
2.2 感受态DH5α的制备
2.2.1 基本原理
转化是将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性
状. 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,可以容忍外源的DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代,受体细胞经过一些特殊的方法,如电击、C a Cl2等化学试剂处理后,细胞膜的通透性增加,成为感受态细胞,使外源的DNA分子可以进入.
2.2.2方法步骤
目前常用的感受态细胞制备方法有电击法和C a Cl2法, 电击法制备效率较高,但C a Cl2法简单易行,且其转化效率可以满足一般的实验要求,因此C a Cl2法使用更为广泛.
C a Cl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤:
准备:（1）配制0.05mol/l的C a Cl2-15％的甘油混合溶液,高温高压灭菌. 注: C a Cl2必须为分析纯以上,
（2）实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌. 注:最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材.
（3）受体菌的培养:从非选择性LB培养基上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜至对数生长期中后期.将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100ml LB培养基中, 37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5. 注:培养时间不宜超过2.5小时,否则不能达到最高转化效率.
实验步骤:
（1）细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4℃5000rpm离心5分钟.
（2）用欲冷的去离子水洗涤沉淀, 4℃5000rpm离心5分钟. （3）沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的C a Cl2-15％的甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟, 0.05mol/l的C a Cl2-15％的甘油混合溶液（4）沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的C a Cl2-15％的甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液.分装成50-100ul的小份,置于-70℃可保存半年.
注:最好在两个月内用完,然后重新制备.若要进一步提高转化效率,可将加入的溶液体积减少到1ml或分装成200ul/管.
电转化法制备感受态大肠杆菌的方法步骤:
（1）前夜接种受体菌（DH5α）,挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜.
（2）取2ml过夜培养物接种于200ml LB培养基中, 37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.5（约2.5-3小时）.
（3）将菌液迅速置于冰上,以下步骤务必在超净工作台和冰上操作.
（4）吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却10分钟.
（5）4℃3000rpm冷冻离心5分钟
（6）弃去上清,加入1500ul冰冷的10％甘油,用移液枪上下吸动打匀,使细胞重新悬浮.
（7）4℃3000rpm冷冻离心5分钟
（8）弃去上清,加入750ul冰冷的10％甘油,用移液枪上下吸动打匀,
使细胞重新悬浮.
（9）4℃3000rpm冷冻离心5分钟
（10）加入20ul冰冷的10％甘油,用移液枪上下吸动打匀,使细胞重新悬浮.
（11）立即使用或迅速置于-70℃超低温保存.
2.3 转化
2.3.1 基本原理
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子.PUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时, LacZ基因失活,转化进入大肠杆菌并在含有IPTG 和X-gal生长时会产生白色的克隆,不含插入片段的PUC18质粒进入宿主细胞,生成蓝色菌落.
2.3.2 方法步骤
（1）在已制好的LB液体培养基（各250ml）中分别加入氨苄青霉素250ul和卡那霉素500ml,摇匀后倒无菌平板,各倒7个,待凝固. （2）用无水乙醇清洗浸泡在75％乙醇中的电击杯,于超净工作台桑吹干或烘箱中烘干.将连接产物和0.1CM的电击被杯一起置于冰上预冷.准备3管800ul的无抗LB,于冰上预冷.
（3）从-70℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻.
（4）取3ul连接产物加入到50-100ul感受态细胞中,混匀后转入电击杯中,轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电击杯的底部.
（5）打开电转仪,将电击杯放入.
（6）按一下Pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入800ul 的LB培养基,重新悬浮细胞后,转移到1.5ml的离心管中.
（7）37℃,100rpm复苏1-1.5h
（8）5000rpm离心5分钟,弃上清剩100ul,取10-50ul（40ul）涂板,放于37℃过夜培养.次日查看转化结果.
2.4 双酶切连接
3.结果讨论
参考文献
Abstract
附录
致谢
如何阅读分析质粒图谱 日期：2012-04-18来源：未知作者：xilu点击：次 如何阅读分析质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 1. 复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 2. 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 3. 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 4. P/E 启动子/增强子 5. Terms 终止信号 6. 加poly(A)信号可以起到稳定mRNA作用 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒) 所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 1. Ampr水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 2. tetr可以阻止四环素进入细胞。 3. camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
4. neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活 5. hygr使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于 大家分享。 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 ＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 ＃核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。l ＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 · 是原核蛋白表达引用最多的系统 · 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 · 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 · 提供各种不同融合标签和表达系统配置 · 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 · 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物 · 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。 有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT
第三章质粒的分子生物学与质粒载体 一、填空题 1．基因工程中有3种主要类型的载体：——-------、------------一、-----------. 2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。 3.质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。在杂种质粒中，每个复制子的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。 4.就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5.如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。 6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。 7.复制子由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------————(3)—--------------—。 8.酵母的2μm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。 9.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。 10.pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于----——，它的四环素抗性基因来自于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来自于—---------—。 11.质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过—------—恢复该基因的性状。 12.ColEl质粒复制的起始需要三种酶，即—-----------—、一------------和一------。 13．YAC的最大容载能力是—-----------—，BAC载体的最大容载能力是—---------—。 14．pSCl01是一种---------——复制的质粒。 15．把那些没有可检测表型的质粒称为—--------------—。 16．转座子主要由下列部分组成：(1)—-----————————(2)---------------—— (3)—----------------—。
酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF， pY15TEF，pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1， 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZα A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115， 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET
一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA的保守序列，此位点down－stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体
第一节质粒载体 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。图3-1 是其复制其始示意图。 在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。 图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复 制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。 2．质粒的拷贝数 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表5-1 就是不同类的质粒与复
制子及拷贝数的大致关系。 表3-1 ：质粒载体及其拷贝数 pUC 系列质粒的复制单位来自质粒pMB1 ，但其拷贝数较高。pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于DNA 的RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、dnaC 、dnaD 和danZ 的产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2～3 千个质粒。3．质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔 5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（ector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle ector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制
质粒载体分类及阅读 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19R DNA pUC57 DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescript II KS (+) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? p ET Expression Systems Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent Cells Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNA Protein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits 四.PGEX系列表达载体 T EcoR pGEX-1 I/BAP pGEX-2T pGEX-2TK pGEX-3X
质 质粒 粒与 与载 载体 体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员 一、质粒 绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。 原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。 二、质粒的类型 当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。这些分型标准之间并无横向关联。你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。 有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R-质 粒(R-plasmids)。有些质粒能在多种不同菌属细胞中生存，我们称它们为泛宿主性质粒 (broad-host-range plasmids)；有一些质粒只能在少数相关宿主中生存，我们称它们为狭宿主 性质粒(narrow-host-range plasmids)。具有结合生殖(conjugation)能力的质粒为结合质粒 (conjugative plasmids)；没有这种能力的质粒便是非结合质粒(non-conjugative plasmids)。其 它如侵袭性质粒(virulence plasmid)、 共生质粒(symbiotic plasmids)及巨型质粒(megaplasmids) 等等有关质粒性状叙述的名词不一而足。 三、质粒的复制 环状质粒的复制形式主要分 theta (θ)及 rolling circle 两种。基因体的复制都是由复制原开始。 原核性复制原约由 250 个碱基对组成，一般质粒的复制原常称为 oriV (origin of vegetative replication)；有时 R-质粒的复制原称为 oriR ；大肠杆菌的复制原称为 oriC 。Theta 形式的质 粒复制与细菌基因体复制一样，以 RNA 聚合脢(RNA polymerase)在复制原制造 RNA 引子 (RNA primer)，然后由 DNA 聚合脢(DNA polymerase)接手由此向两个方向分别复制 DNA ， 直到整个基因体复制完成。在复制过程中当然还有许多其它酵素的参与，这些酵素多由宿主 提供。有的质粒自己携带一些与复制有关的基因，这些基因多被命名为 rep ，如 repA 、repB
酿酒酵母表达载体 pYES2,ｐYES２／NT,ｐYＥS２/CT,pYES3,pYES6,pYCｐlａｃ2２-GＦP, 酵母载体pAUR12３,pRS３03TEF,pRS30４, pRS305,pRS306,ｐY13ＴEF,ｐ Y14TEＦ,pY１５TEF,pＹ16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6,pＳH４７, 酵母单杂载体pHISｉ,pLacZi,pHIＳ2, pGＡD4２4, 酵母双杂交系统:酿酒酵母 Y187, 酿酒酵母AＨ109;质粒pGADＴ7,pGBＫT７;对照质粒pGBKT7－5３,pGBKT７-lam,pGＡDＴ７-T,PCＬ1, 酿酒酵母菌株ＩＮＶＳc1,YM42７1, AH109,Y1８７,Y１９0, 毕赤酵母表达载体pPＩＣ9K,pPIC9Ｋ-His,pPＩＣ3.5K,ｐＰICZalｐhaＡ,B,C,ｐP ＩCZA,B,C,ｐGAPZαA,ｐAＯ8１5,pPIC9k-Hｉs,pＨIL-S1,pＰink ｈc, 配套毕赤酵母Pｉcｈiaｐiｎk, 毕赤酵母宿主Ｘ33,KＭ７１,KM71H,GS115, 原核表达载体pQＥ30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括ｐET系列,ｐＥ T-GST,pGEX系列(含GＳT标签),pMAL系列pMＡL-c2x,－c4x,－ c4e,-c5x,-p5x,pＢＡD,pBAＤHis,ｐＢADmycHis系列,ｐQE系列,pＴｒｃ9９ a,pTrcＨis系列,pＢV２2０,22１,222,pTＸＢ系列,ｐLＬP-oｍ pA,pIN-III-ompA(分泌型表达系列),pQBI6３(原核表达带荧光)pEＴ3a, pET 3d, pET 11a,ｐEＴ12a, ｐEＴ14b, ｐＥT 15b, pＥT 16b, pＥT 17b,pET 19b, pET 2０b, pET 21a,b,d, pET ２2b,ｐET ２3a,ｐET 23b, pET24a,b,pET ２5ｂ, pET 2６b, ｐEＴ27b, pET ２8a,b, pET 29a,pET 30a, pET 31b, pET32a, pEＴ35b, pET 38b, pEＴ３９b,pET 40b, pEＴ４１ａ,b pET 42a,pＥT 43、1ａ,b pET 44ａ, ｐEＴ49ｂpEＴ３０2,303 pET His,pET Dsｂ,ｐET GST,ｐＥT Trx pＱE2, ｐQE9 pQE30,31,32, pQE 4０ｐQＥ７０pQE80L pＱＥTirs sｙstem pR ＳET-A pRSEＴ-B pRSET－C pGEX4T-1,-2,－3,５ｘ-１,6p-1,６p-2,2ｔk,3c ｐＢV22０,221,222 ｐTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAＤＨｉsＡ,B,C pPinPoiｎｔ-Ｘa1,Xa2,Xａ3 pMALc2x, p2x pＢV220 pGEM Ex1, pGEＭ7ZF(+), pＴrｃ99Ａ,ｐTwin1, pEZZ18ｐkk232－８,pｋk ２33-３,pAＣYＣ１８4,pBR３２2,ｐ UC119 pＴYB1,pTYB2,pTYB4,pTＹB11 pＢlueＳcript SK(+),pＢlueSｃript SK(－) ｐLＬP ompA, ｐＩNIIIomｐA,ｐMＢP-P,pＭBP-Ｃ, 大肠杆菌冷激质粒: p ＣｏｌdＩpColｄII ｐColdIIＩpCｏldTF 原核共表达质粒:pＡCYCｄuet－1,ｐ
一、如何阅读质粒图谱 载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。 而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。 如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 二、相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核l基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 l转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载
质粒载体的概述及提取 生物技术112班第2学习小组姓名：鲍臻学号：2011013410 本次研讨方向：质粒载体的概述及提取方法介绍 质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒 所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰 式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。 质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质 粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于 细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它 们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带 有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、 对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有 机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。 目前提取质粒DNA的方法有两种：煮沸法和碱变性抽提法，而决定用哪种方法是根据 质粒载体的特征来决定的。包括:质粒载体的大小，宿主大肠杆菌的菌株特性及纯化质粒DNA方法。 目前各实验室最常用的质粒DNA提取方法。提取原理主要是根据细菌染色体DNA分子 比质粒DNA分子大得多，也复杂得多，所以染色体DNA和质粒DNA的变性和复性过程有较 大差异，从而达到分离目的。 在pH12的碱性条件下，线性染色体DNA和蛋白质变性充分。质粒DNA大部分氢链也断裂变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8 的KAc的高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA容易恢复到原来的构型，溶解在溶液中，而染色体DNA不能完全恢复原构型，而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA，大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等会一起沉淀。这样将质粒DNA分离出。 实验的步骤： 1.取1~1.5mL过夜培养的细菌加入eppendorf管中，置冰水中。 2.10000~12000 rpm，室温离心5分钟。 3.去上清（如沉淀太少，可再加1~1.5mL菌液，再离心沉淀一次），加入预冷的溶液 I 100 μL（50mmol/L 蔗糖，25mmol/L Tris-HC1pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）， 振荡器上振混匀。
质粒载体的构建 摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。 关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化 1.引言 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体
都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。 质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。 质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料方法 2.1目的DNA的获得 2.1.1 引物设计 第一次引物设计： 正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a 引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’ 引物长度：25bp 反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b
（转载） 一.九种表达载体 Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C, pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA 二.克隆载体 pTZ19RDNA pUC57DNA PMD18T PQE30 pUC18 pUC19 pTrcHisA pTrxFus pRSET-A pRSET-B pVAX1 PBR322 pbv220 pBluescriptIIKS( ) L4440 pCAMBIA-1301 pMAL-p2X pGD926 三.PET系列表达载体 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44 ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits 四.PGEX系列表达载体 TEcoR?pGEX-1I/BAP
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发
酿酒酵母表达载体 p YES2 ,p YES2/NT ,p YES2/CT ,p YES3 ,p YES6, pYCp Iac22-GF P, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF PY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体p UG6, p SH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109 ;质粒PGADT7,pGBKT7 ；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T , PCL1, 酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109，丫187，丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc， 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列， pET-GST, PGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列 pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系 列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-HI-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His, pET Dsb, pET GST, pET Trx p QE2, pQE9 p QE30,31,32, pQE 40 p QE70 pQE80L p QETirs system pRSET-A pRSET-B p RSET-C p GEX4T-1,-2,-3,5x-1,6 p-1,6 p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinP oi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233-3, PACYC184, pBR322 ,p UC119 p TYB1, pTYB2, pTYB4, pTYB11 p BIueScri pt SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒： pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：PG-KJE8 PGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103 JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21( DE3) HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL- 10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21 ( AI) BL21