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载体构建流程课件

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基因表达载体的构建PPT课件

基因表达载体的构建PPT课件
• 无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时， 乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2
• 而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- β-D-半乳糖）诱导转录。 Lac启动子改建 如图6-3、6-4(a) (b)
第25页/共49页
第27页/共49页
噬菌体的PL和PR启动子
• PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR 转录，但CI在42℃诱导转 录（如图6-8）。
第28页/共49页
脂蛋白启动子（LPP）
• 脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高，该启动子表达效率高，由信号肽可将基因表达产物分泌到胞外， 常用来构造分泌型表达载体。
第7页/共49页
㈢ 原核表达载体的构建
• 原核表达载体的构建的要求 • 1.表达载体类型 • 2.表达载体的举例 • 3.包涵体表达载体
第8页/共49页
启动子
• ⑴ 乳糖启动子（Lac） • ⑵ Trp启动子 • ⑶ Tac启动子 • ⑷ 噬菌体的PL和PR启动子 • ⑸ 脂蛋白启动子（LPP）
表达载体类型
• 表达载体的类型主要有四种： 1. 非融合型表达载体，如PKK223-3 如图6-14 2. 分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1 如图6-15 3. 融合蛋白型表达载体，如PGEX 如图6-16 4. 包涵体型表达载体，如pBV220 如图6-17
第23页/共49页
原核表达载体的构建的要求
第3页/共49页
二、基因表达的基本条件
• 1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框 架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。 否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基 因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。

工程菌构建载体介绍课件

工程菌构建载体介绍课件

PART 03
载体构建原理
质粒载体构建原理
质粒定义
质粒是一种裸露的、自我复制的双链环状DNA分 子，能稳定地独立存在于宿主细胞染色质或自主 复制的质粒DNA上，并表达其所携带的遗传信息。
质粒复制
质粒复制涉及复制起点、复制子、复制酶等要素， 通过复制酶的催化完成。
质粒特点
质粒具有分子量小、拷贝数高、不整合于宿主染 色体等特点。
基因表达元件包括启动子、 增强子、沉默子等，负责调 控基因的表达。
表达载体构建
通过基因工程技术将目的基 因插入表达载体，再导入受 体细胞，使目的基因得以表 达。
表达产物检测
通过检测表达产物的量与性 质，评估目的基因的表达情 况。
PART 04
载体构建流程
目的基因的
详细描述
基因工程在生物工程中具有广泛的应用价值，它可以 为农业提供抗病、抗虫和抗逆的转基因作物，提高产 量和降低农药使用；在医药领域，基因工程技术可用 于生产重组蛋白药物、基因治疗和疫苗开发等；在工 业领域，基因工程可用于微生物发酵生产化学品、生 物燃料和酶等；此外，基因工程还可用于环保领域， 如降解污染物和修复生态等。
ONE
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工程菌构建载体介绍 课件
目 录
• 工程菌与基因工程 • 载体构建原理 • 载体构建流程 • 载体构建的实验操作 • 载体构建的应用与展望
PART 01
引言
目的和背景
介绍工程菌构建载体 的概念和应用领域
探讨工程菌构建载体 在生物工程领域的重 要性和意义
分析工程菌构建载体 的研究现状和发展趋 势
实验试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、 DNA聚合酶、dNTPs等。
实验步骤与注意事项

载体构建流程

载体构建流程

菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。

酶切检测阳性克隆


将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
挑取阳性克隆去测序


测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。 不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修 补。
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
连接

载体构建流程课件

载体构建流程课件
经典载体构建流程
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目旳基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目旳基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确旳摇菌提质粒
导入体现宿主 测试体现情况
提取mRNA
假如可能，试验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定时进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以防止将手、 臂上旳细菌和真菌以及人体本身分泌旳RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油旳终浓度控制在10%下列，以防止出 现星号活性，可经过增长反应体系旳总体积旳措 施实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
一般此步是必要旳，能够对比未经纯化旳酶切产 物进行连接后取得旳阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步旳目旳是清除多出旳片段，得到单一纯化旳 目旳基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
谢谢！
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性旳LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞旳效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应当代分子生物学试验室批量工作 旳高效性，一般只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
切胶回收PCR产物时，防止DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。

载体构建流程优秀课件

载体构建流程优秀课件
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。

1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】

1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT )【优 秀课件 】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）

载体构建流程pp课件

载体构建流程pp课件
• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
15
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
16
连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
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酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
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挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。

《载体构建流程》课件

《载体构建流程》课件
度。
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述

人教版生物选修三1.2节DNA重组技术的基本操作程序(2)基因表达载体的构建课件(共18张PPT)(

人教版生物选修三1.2节DNA重组技术的基本操作程序(2)基因表达载体的构建课件(共18张PPT)(
组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添 加 抗生素B 的培养基进行培养。
巩 固提 高
例2、【2016年江苏高考33题（节选）】下表是几种限制酶识别序 列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中 切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用
抗生素 抗性基因
破 思考讨论：
选用EcoRⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割外源DNA和质粒，
可以形成哪些连接产物？
质粒和含目的基因的外源DNA正向连接
限制酶的选择：EcoRⅠ和HindⅢ切割结果分析
EcoRⅠ
… GAATTC … CTTAAG
目的基因
HindⅢ
AAGCTT … TTCGAA…
HindⅢ EcoRⅠ
BclⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶切割。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板
培养基中添加
四环素 。
筛选导入重组质粒的受体细胞
【2019年江苏高考33题（改编）】下图是某基因工程中构建
重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（
tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。
模拟制作——基因表达载体的构建
方法步骤
3.一种限制酶切割：用剪刀（代表EcoRⅠ，识别序列及切
割位点为G↓AATTC）切割“质粒”和“含目的基因的外源 DNA”。用双手代表DNA连接酶，分别体验质粒自身环 化、含目的基因的外源DNA自身环化、质粒和含目的基因 的外源DNA正、反向连接的过程。
1和2连接， 1 '和2'连接 正向 相互连接
1和2'连接，1 '和2连接 反向

2基因表达载体的构建PPT下载

2基因表达载体的构建PPT下载
2基因表达载体的构建PPT下载
2基因表达载体的构建PPT下载
4.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失 活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）．有人将此质 粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接 酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被 转化，有的被转化．被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含 有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌．回答下列问题：
_二__者__均__含__有__氨__苄__青__霉__素__抗__性__基__因__，__在__该__培__养__基__上__均__能__生__长__。_
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大 肠杆菌的单菌落，还需使用含有___四__环__素___的固体培养基．
2基因表达伸
• 模板、引物、Taq 酶、4种dNTP
人工合成 • 基因小
• 序列已知
2基因表达载体的构建PPT下载
导入 受体细胞
目的基因 检测鉴定
2基因表达载体的构建PPT下载
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶 B.抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子 C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的 受体细胞 D.抗虫基因的表达启动于复制原点
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直

植物基因工程载体和其构建培训课件

植物基因工程载体和其构建培训课件

建
植物基因工程载体和其构
32
建
TOPO技术
拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重 新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。
TOPO克隆是一种将拓扑异构酶 与 T- 载体相结合的 PCR 产物 快速克隆系统 pCR-TOPO ，无 需 DNA 连接酶做连接。
3'末端的突出 T 上共价结合 了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当 带 3' 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时， 拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口 连接起来。
（1）T载体
PCR产物往往在3’端突出一个或多个A， 将T-载体的MCS中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 所以能与这个载体直接连接，这种克隆称为T-A克隆。
➢ 克隆载体线性化； ➢ 克隆载体末端补平； ➢ 克隆载体末端加T。
植物基因工程载体和其构
29
建
➢ 商业化T载体 一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内
➢ 长度：4361 bp；
➢ 选标记：氨苄青霉素和四环素抗性；
➢ 多克隆位点：24个克隆位点；
其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。
植物基因工程载体和其构
23
建
衍生质粒：pBR325、pBR327及pAT153等。
植物基因工程载体和其构
27
建
（3）pBluescript II KS(±)系列载体
在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和T3。可对插 入片段进行转录。还加入了丝状噬菌体f1的复制起点。
植物基因工程载体和其构
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基因表达载体构建课件

基因表达载体构建课件
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
二 基因表达载体的构建
思考与讨论：
1 基因载体必须具备的基本条件是什么？ 2 基因工程可做载体的结构有那些？最 常 使 用 的载体是什么？ 3 请图示大肠杆菌质粒结构。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基 因——质粒重组DNA分子。
3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞 混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重 组DNA分子，完成转化过程。
世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转 基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
（三）
将目的基因导入微生物细胞
目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是：
1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够 吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称 为感受态细胞。
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利

基因工程-2-载体ppt课件

基因工程-2-载体ppt课件
③易操作,id)
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
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条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不 一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
载体构建流程
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解决方法
• 假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物 为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重 新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限制性内切酶干扰 后续连接反应，降低阳性率。
载体构建流程
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回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
载体构建流程
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连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯 键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端残 基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 所以此步对整个分子克隆都至关重要，可适当用酚抽提、柱纯化， 必要的话也可以胶回收。
载体构建流程
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酶切目的基因和载体
载体构建流程
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酶切注意事项
• 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再 切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若 盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求 的。只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加 入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
• 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可 通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
载体构建流程
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酶切常见问题
载体构建流程
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纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产物进行连接后获 得的阳性克隆大大低于胶回收酶切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的目的基因与载体 骨架，使之连接不受其他序列干扰。
• 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非 特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性 扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一 来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当 提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
引物设计合理等。
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
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载体构建流程
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载体构建流程
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PCR常出现的问题
• 1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
载体构建流程
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PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋白、离子等会造成酶 切困难或星活性，残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆失 败。
• 根据不同的目的，可有三类引物选择
载体构建流程
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载体构建流程
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PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。 由于此步为获 取正确的目的基 因，所以尽量避 免PCR的突变格
94
温
度 72
（℃）
55
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
（6）将平板置于室温直至液体被吸收。
（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
载体构建流程
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菌落PCR
经典载体构建流程
载体构建流程
1
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
Hale Waihona Puke 酶切目的基因和载体保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
载体构建流程
导入表达宿主
测试表达情况
2
载体构建流程
3
提取mRNA
• 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试 剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作 过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用 具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管 等塑料制品 采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
载体构建流程
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载体构建流程
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转化
• 基本步骤：
（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。
（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。
（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。
（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。
载体构建流程
4
RT
• 由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来 的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片段克 隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也不能 在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要克隆 真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码的 mRNA为模板。
• PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须通 过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为 模板扩增目的基因。