载体构建
载体种类： 载体种类：
1.原核表达载体 2.真核表达载体 3.病毒表达载体（是真核载体的一种） 4.克隆载体
构建载体种类取决与实验的需要： 构建载体种类取决与实验的需要 本实验最常见的载体构建类型： 1. 构建基因表达载体 2. 构建microRNA表达载体 3. 构建shRNA干扰载体
基因表达载体的构建： 基因表达载体的构建 考虑问题： 考虑问题： 1. 选用什么样的表达载体？ 选用什么样的表达载体？
1）普通真核表达载体 ） 2）病毒载体 ） ①慢病毒载体（因模板从哪里来？
1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的
基因模板从哪里来？ 基因模板从哪里来？ 1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 引物设计最好采用巢式PCR方法 方法 引物设计最好采用巢式
5‘非翻译区 CDS区 3‘非翻译区
（内引物） 内引物） 初次PCR引物设计（外引物） 引物设计（外引物） 初次 引物设计 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的 直接设计与载体匹配的引物
在本次载体构 建：可以添加 AC,最后与C 组成三联体密 码（只要不是 终止码）
后续过程： 1.NESG1 PCR 扩增，纯化，EcoRI和KpnI酶切，纯化
2.质粒扩增，提取纯化, EcoRI和KpnI酶切线性化，低浓度琼脂糖电泳，胶回 收纯化 3.模板与线性化质粒连接
4.转化感受态大肠杆菌
5.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）
选择载体的优缺点： 选择载体的优缺点： 1.普通真核表达载体 普通真核表达载体 优点：多克隆位点比较多， 优点：多克隆位点比较多，易于构建 缺点：建立稳定转染细胞时间长， 缺点：建立稳定转染细胞时间长，耗时耗力
